SPME-GC-MS結合ROAV分析腌制時間對大河烏豬火腿揮發性風味物質的影響

王 藤，施婭楠，李 祥，黃艾祥,

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明 650201；2.云南東恒經貿集團有限公司，云南曲靖 655000）

大河烏豬因其肉質好、營養豐富、風味獨特聞名[1?2]。大河烏豬火腿是采用10 kg以上的新鮮后腿為原料，經預冷排酸、上鹽腌制、脫水平衡、掛曬發酵等加工而成。風味是干腌火腿最重要的指標之一，不同揮發性風味物質的組成賦予產品不同的風味特征[3]。有關火腿風味的研究主要采用氣相色譜-質譜聯用技術、氣相色譜-嗅味計技術及電子鼻技術等。Théron等[4]利用GC-MS結合GC-O分析及鑒定巴約那火腿中的揮發性物質和氣味活性成分。食品的揮發性化合物不僅與含量有關，還與感覺閾值有關。相對氣味活度值（ROAV）法是一種確定食品中關鍵揮發性化合物的方法[5]；Sun等[6]通過ROAV法確定了燉雞的風味成分。

目前，許多學者對宣威火腿、金華火腿中的理化成分、揮發性風味物質[7?9]、加工工藝進行了研究[10?12]，而對大河烏豬火腿的研究卻很鮮見，Shi等[13]揭示了大河烏豬火腿腌制24 d后自然發酵過程中風味化合物的變化。其次，腌制具有改善肉的色、香、味，防腐的作用，有關肉制品腌制的報道主要集中于比較不同腌制方式對肉制品的腌制效果[14]及腌制對肉制品食用品質的影響[15]，而腌制時間對肉制品風味物質影響的研究鮮有報道，譚汝成[16]研究表明腌制能促進前體物質的轉化和風味物質的形成。

因此，本研究采用SPEM-GC-MS結合ROAV對大河烏豬干腌火腿在4個不同腌制時間（15、18、21、24 d）加工過程中的揮發性化合物進行鑒定，研究不同腌制時間對揮發性化合物的變化及形成的影響，以期為大河烏豬干腌火腿加工工藝優化及品質控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大河烏豬火腿10±1 kg，云南東恒經貿集團有限公司提供；甲醇色譜級 美國Sigma公司。

含SPME裝置的多功能樣品處理平臺、SPME萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS） 美國Supelco公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大河烏豬干腌火腿的生產 新鮮后腿：10±1 kg的大河烏豬鮮后腿；

預冷排酸：3±1 ℃、RH=85%~90%室內冷涼18 h以上，使腿中心溫度3~4 ℃；

俢割整形：用快刀剔除“吊肉”，刮盡殘毛，擠出血水，將腿修割成橢圓形、肌肉外露；

低溫上鹽腌制：采用上鹽堆碼干腌腌制，按每只鮮腿重的5.5%稱取食鹽，再按食鹽總重50%、30%、20%的比例，分別在第1、3、15 d搓揉上鹽并翻堆后堆碼腌制，腌制條件（3±1 ℃、RH=85%）；

中溫脫水平衡：60 d，6±1 ℃、RH=75%~80%；

高溫發酵產香：270 d，23±1 ℃、RH=65%；

質檢成品。

1.2.2 火腿采樣 從腌制時間為（15、18、21、24 d）的4個組中分別隨機抽取4只火腿樣品，共計16只，將半膜肌和股二頭肌混合，真空包裝并保存在

?20 ℃。

1.2.3 SPME-GC-MS聯用技術分析頂空固相微萃取條件 參照Huan等[17]的方法，稱取已攪碎的肉樣5.00 g于20 mL頂空瓶中；將老化后的萃取頭插入頂空瓶上部，50 ℃吸附40 min，210 ℃解析5 min。

GC條件參照高韶婷等[18]的方法，略做修改。色譜柱：DB-5 MS毛細色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以12 ℃/min升至250 ℃并保持7 min；載氣He（純度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；進樣量0.5 μL；分流比1:30。

MS條件傳輸線溫度280 ℃，離子源EI，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，數據采集模式為全掃描（Scan），質量掃描范圍m/z 50~450 amu。

1.2.4 揮發性風味物質的鑒定 揮發性物質的定性：揮發性化合物利用NIST08.L譜庫的標準質譜圖對得到的譜圖數據進行串聯檢索和人工解析，獲得未知化合物與質譜庫中已知化合物的匹配度，匹配度大于80即初步確定未知物為該物質。

揮發性物質的定量：采用峰面積歸一化法[19]。

關鍵揮發性物質評定方法：采用相對香氣活度值法（relative odor activity value，ROAV）[20]。

式中：ROAVi為某揮發性風味物質的相對氣味活度值；Ci為某揮發性風味物質的相對含量；Tstan為氣味貢獻最大揮發性風味物質的閾值；Cstan為氣味貢獻最大揮發性風味物質的相對含量；Ti為某揮發性風味物質的閾值。

1.3 數據處理

采用Excel 2019進行數據處理，SIMCA14.1、OriginPro2019b繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同腌制時間對大河烏豬火腿揮發性成分的影響

不同腌制時間下的大河烏豬火腿的揮發性風味物質鑒定結果如表1所示；腌制時間對揮發性風味物質的種類及相對含量的影響如表2所示。

從表1~表2可見：4個不同腌制期的揮發性物質種類與含量均存在差異。共鑒定出77種揮發性化合物，包括醛類15種、醇類13種、烴類10種、酮類4種、酯類5種、酸類8種、芳香族化合物9種、其他13種；且腌制15、18、21、24 d的揮發性成分的種類分別為57、57、54、41種。不同腌制時間的大河烏豬火腿共有的揮發性風味物質包括醛類（異戊醛、己醛等）；醇類（乙醇、正己醇等）；酮類（2,3-辛二酮等）；酸類（丁酸、異戊酸、己酸等）。醛類和醇類在每個腌制期中二者含量之和超過揮發性風味成分總量的一半。此外，有些物質隨著腌制時間的延長而消失，例如反-2-辛烯醛、肉豆蔻醛、1-戊醇等。

表 1 不同腌制時間的大河烏豬火腿揮發性風味物質Table 1 Volatile compounds of Dahe black pig ham under different curing time

表 2 腌制時間對揮發性風味物質的種類及相對含量的影響Table 2 Effects of curing time on the types and relative content of volatile flavor substances

續表 1

在4個腌制期中，檢測到醛類物質的相對含量最多，此結果與Sabio等[23]在研究巴約訥、伊比利亞火腿時得出的結果一致。己醛、壬醛是大河烏豬火腿中含量最豐富的醛類，研究結果與伊斯特拉火腿的典型特征風味物質相似[24]。此外，醛類化合物含量隨著腌制期的延長沒有規律性，分別為52.08%、40.84%、64.26%、34.91%，推測由于醛類物質化學性質活潑，在腌制過程中受溫度、時間等影響，導致其相對含量變化。醇類化合物主要來自脂質氧化、氨基酸降解[25]。醇類化合物的相對含量隨著腌制時間而增加，可能是腌制過程中食鹽的生物滲透作用能夠加速酯類氧化，NaCl破壞細胞膜的完整性，促使氧化劑進入脂質基質來促進脂質氧化[26]。本研究共鑒定出13種醇，含量最豐富的是1-辛烯-3-醇，與Radov?i?等[27]的報道一致，其已被鑒定為金華火腿、如皋火腿、盤縣火腿的特征風味[28?29]。來自于脂肪酸烷氧自由基均裂的烴類物質[29]閾值較高。隨腌制時間的延長，烴類物質的種類幾乎保持不變，當腌制期為21 d時，其相對含量最低，為2.24%，其相對含量突然驟降是由于1,1,3,3-四乙氧基丙烷在其余3個腌制期中含量較高但在此階段未檢出。

酮類化合物來源于微生物代謝、脂肪氧化，具有奶油味、果香味[30]。在大河烏豬火腿中，酮類物質含量較低，且2-壬酮為主要酮類物質。由酸和醇經酯化作用而成的酯類大多具有果香味。本研究中，隨腌制時間的延長，酯類化合物相對含量呈先增加后降低的趨勢，推測原因可能是在腌制15、18、21 d時，生成的酯類含量大于酯類氧化消耗的，而腌制24 d時，酯類氧化的速度加快，所消耗的量增多。酸類化合物來源于甘油和磷酸的氧化降解、美拉德反應[31]。在4個腌制期均檢測到了丁酸、異戊酸、己酸、辛酸、癸酸。隨腌制時間的增加，酸類物質的相對含量呈現先增加后降低的趨勢，且在18 d達最大值，為5.68%。可能由于腌制時間低于18 d時，原料表面的微生物作用產酸使火腿中的酸類物質增加，而隨著腌制時間的延長，火腿中的食鹽濃度達到一定程度，從而發揮防腐作用，抑制微生物的生長[32]。苯類物質具有較高的閾值，對火腿風味貢獻較小。不同腌制時間下加工的大河烏豬火腿分別檢測出7、6、2、5種芳香族類風味物質，苯乙烯和4-甲基苯酚是4個腌制期均存在的風味物質。

在其他類中，鑒定出多種雜環類化合物、吡嗪類等。雜環類化合物由于通過硫胺素的降解、氨基酸的熱解形成，多數具有肉香。其次，吡嗪類化合物賦予肉品堅果及烘烤香味[33]。在大河烏豬火腿中，檢測到的吡嗪類物質有2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪。在盤縣火腿、金華火腿中均鑒定出多種雜環類化合物、吡嗪類物質[28?29]。

2.2 揮發性化合物聚類分析（HCA）

為進一步觀察4個腌制期的火腿樣品組間和組內的相似程度與差異，采用SIMCA14.1繪制聚類圖，以77種風味物質含量為變量，其聚類分析結果顯示（圖1），由圖（樣品編號1~4、5~8、9~12、13~16分別表示腌制15、18、21、24 d的火腿樣品）4個不同腌制時間的大河烏豬火腿樣品被聚為2大類（腌制15、18 d和腌制21、24 d聚在一起）和4個小類（1~4、5~8、9~12、13~16聚在一起），說明4個不同腌制時間的火腿樣品具有明顯差異，即揮發性物質的組成及相對含量存在較大的差異。故利用聚圖能很好地區分不同腌制時間大河烏豬火腿的揮發性風味。

圖 1 不同腌制時間下大河烏豬火腿的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of Dahe black pig ham under different curing time

2.3 ROAV鑒定不同腌制時間的關鍵性風味物質

結合各風味物質的感覺閾值，計算ROAV值，進一步確定大河烏豬火腿的關鍵性風味物質。通過相關文獻共找到38種揮發性物質的氣味閾值（見表1）[21?22]。因此，本實驗只對查詢到閾值的風味物質做出分析。當0.1≤ROAV<1時，該揮發性物質對火腿的總體風味起輔助作用；ROAV≥1時，該揮發性物質為火腿的關鍵風味物質；在不同腌制時間大河烏豬火腿的揮發性風味物質中（表1），壬醛的相對含量較高，且閾值只有1 μg/kg，故對風味貢獻較大。以壬醛作為基準物來計算其他揮發性化合物的ROAV，則壬醛的ROAV為100。對各相關組分的ROAV分析結果如表3。

由表3可知，4個不同腌制時間的大河烏豬火腿中，ROAV≥0.1的共有11種醛類、3種醇類、2種烴類、2種酮類、2種芳香族化合物、1種呋喃類。腌制15、18、21、24 d火腿的關鍵性風味物質（ROAV≥1）分別為11、10、10、9種。異戊醛、己醛、庚醛、正辛醛、1-辛烯-3-醇、庚醇、2,3-辛二酮是4個不同腌制時期的關鍵性風味物質；其中，醛類為主要的關鍵風味物質，醛類主要呈堅果味、油脂味、青草味且多數醛類物質對火腿風味起積極貢獻的作用[33]。其次，對大河烏豬火腿有重要修飾作用的風味物質分別為苯甲醛、2-正戊基呋喃。當腌制期18 d時，己醛的ROAV值是4個腌制期中最低的，為21.85。已醛呈強烈的生油脂味，含量過多則會使人發嘔。由此可見，大河烏豬火腿風味形成與腌制密切相關。

表 3 不同腌制時間下大河烏豬火腿關鍵性風味物質及對應的ROAVTable 3 Key flavor compounds of Dahe black pig ham and corresponding ROAV under different curing time

2.4 關鍵揮發性化合物的PCA

為進一步研究4個腌制期對大河烏豬干腌火腿揮發性風味物質的影響，選取14種對大河烏豬干腌火腿揮發性風味有貢獻（ROAV≥1）的化合物進行PCA，得分圖和載荷圖分別如圖2所示。

由圖2可知，4個腌制時間的PC1貢獻的方差為55.83%，PC2貢獻的方差為27.84%，前兩個主成分的累積方差貢獻率為83.67%，能較好地反映原始數據的絕大部分信息。其中，PC1中載荷正向最高的物質為1-辛烯-3-醇，載荷負向最高的物質為異戊醛；PC2中載荷正向最高的物質為正辛醛，載荷負向最高的物質為雙戊烯。上述結果說明1-辛烯-3-醇、異戊醛、正辛醛、雙戊烯是不同腌制期火腿中含量變化最明顯的揮發性物質，因此，可以根據上述物質區分不同腌制時間的大河烏豬火腿。

不同腌制時間的大河烏豬火腿總體可分為4類，腌制15、18、21、24 d的樣品各自聚為一類且具有較明顯的分離趨勢，說明這4個腌制期關鍵中風味物質含量和種類存在較大差異，與聚類（圖1）結果一致，表明腌制時間對大河烏豬火腿的揮發性風味物質有一定影響。

圖 2 不同腌制時間下大河烏豬火腿關鍵揮發性化合物主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of key volatile compounds of Dahe black pig ham under different curing time

3 結論

腌制時間影響大河烏豬火腿揮發性風味物質的形成，腌制15、18、21、24 d的揮發性成分的種類分別為57、57、54、41種，共鑒定出醛類、醇類、烴類等揮發性化合物共77種，醛類物質相對含量最多；聚類分析表明4個不同腌制時間的火腿樣品具有明顯差異，即揮發性物質的組成及相對含量存在較大的差異；ROAV分析表明腌制15、18、21、24 d的關鍵揮發性化合物（ROAV≥1）的種類分別為11、10、10、9種；異戊醛、己醛、庚醛、正辛醛、1-辛烯-3-醇、庚醇、2,3-辛二酮為關鍵揮發性化合物；PCA表明1-辛烯-3-醇、異戊醛、正辛醛、雙戊烯是不同腌制期火腿中相對含量變化最明顯的揮發性物質。本研究結果可為大河烏豬火腿工藝技術的優化和風味品質的改良提供理論依據。