姜黃素超分子包合物對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷的保護作用

范土貴，陳建平, ，高加龍，鐘賽意，秦小明

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東省海洋生物制品工程實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心，廣東湛江 524088；2.大連工業(yè)大學(xué)，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116034）

眾所周知，肝臟是人體重要代謝器官，能將不利于體內(nèi)代謝的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)排出體外[1]。長期飲酒及過量飲酒會對人體肝臟造成傷害，導(dǎo)致酒精性肝損傷繼而在嚴重情況下引發(fā)肝癌[2]。因此，如何有效地保護肝臟免受酒精的損傷從而預(yù)防肝癌的發(fā)生成為目前醫(yī)藥和食品領(lǐng)域研究的熱點。近年來，具有低毒副作用、多途徑、多靶點作用的天然產(chǎn)物如黃酮類和多酚類等備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，這類天然產(chǎn)物能夠通過提高肝臟組織的抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激和抗細胞凋亡的能力以及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、乙醇代謝和腸道微生物等途徑改善肝損傷，從而保護肝臟組織[3]。

姜黃素是一種從姜科植物根莖中提取得到的脂溶性多酚類物質(zhì)[4]。作為一種食品添加劑，姜黃素廣泛應(yīng)用于糕點、罐頭、飲料等食品中[5]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有很好的護肝效應(yīng)，可降低酒精、四氯化碳、硫代乙酰胺等各種化學(xué)藥物引起的肝損傷[6?9]。進一步的機理研究表明，姜黃素通過能夠上調(diào)Nrf2-ARE信號通路中Nrf2蛋白的表達量來保護肝臟[10?11]。因此，姜黃素具有較好的應(yīng)用前景。然而，姜黃素的水溶性差及生物利用度低限制了它在酒精性肝損傷防治方面的應(yīng)用。為此本課題組在前期研究中，利用β-環(huán)糊精聚合物作為藥物載體，通過超分子化學(xué)作用制備得到了水溶性和抗氧化活性良好的CUR/CDP[12]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，主要考察CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷的保護作用，為其在保護酒精性肝損傷中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素超分子包合物 實驗室自制；姜黃素（Curcumin, CUR）標(biāo)準品 美國Sigma公司；細胞裂解液RAPI、BCA蛋白測試盒和活性氧檢測試劑盒

碧云天生物技術(shù)有限公司；總超氧化物歧化酶測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、丙二醛測試盒、乳酸脫氫酶測試盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測試盒和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測試盒 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清、PBS、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液和雙抗溶液 美國Gibco公司；異丙醇、二甲基亞砜（DMSO）溶液 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；MTT試劑 分析純，上海源葉生物科技有限公司；LO2細胞 購于美國ATCC公司;β-環(huán)糊精 化學(xué)純，山東新大精細化工有限公司；其他化學(xué)試劑 均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

AUW120電子天平 日本島津公司；XRDKQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀、移液槍 美國Thermo Fisher Scientific公司；DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科學(xué)有限公司；HL-6數(shù)顯恒溫水浴鍋

常州奧華儀器有限公司；Eppendorf 5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；FD8508真空冷凍干燥機

韓國ilshin公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司；CKX41倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CUR/CDP的制備 CUR/CDP的具體制備方法參考陳建平等[13?14]方法進行。稱取15.76 g NaOH和20 gβ-環(huán)糊精，加32 mL H2O攪拌溶解，在30 ℃下緩慢加入環(huán)氧氯丙烷（EPC）9.64 mL，攪拌24 h后，冷卻至室溫。經(jīng)超聲功率為80 W超聲5 min后，將溶液倒入透析袋屮透析至中性，抽濾去除不溶物，經(jīng)0.45 μm纖維素膜過濾后旋蒸至粘稠狀，加入無水乙醇析出白色固體，經(jīng)過濾、真空干燥即得β-環(huán)糊精聚合物。將姜黃素和β-環(huán)糊精聚合物按質(zhì)量比1:4研磨混勻，加50 mL蒸餾水，在120 W下超聲5 min后，經(jīng)磁力攪拌2 d，將溶液抽濾、旋蒸和真空干燥，即得水溶性姜黃素超分子包合物。

1.2.2 細胞培養(yǎng) LO2細胞經(jīng)復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗溶液）中，并將細胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度長至80%左右時進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)的實驗。

1.2.3 乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷模型的建立 在實驗組與對照組加入8×104個細胞/mL的細胞懸液于96孔板中，而空白組中用DMEM高糖培養(yǎng)基代替細胞懸液，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基，然后，實驗組中加入200 μL不同濃度（100~800 mmol/L）的乙醇溶液，而空白組和對照組中均分別加入200 μL DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT孵育4 h。然后，用注射器抽掉上清液，加入150 μL DMSO反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀測量各個孔在570 nm處的吸光值。根據(jù)公式（1）計算細胞存活率。

式中：A0表示空白組的OD值；A1表示對照組的OD值；A2表示實驗組的OD值。

1.2.4 CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷的影響

在實驗組與陰性對照組加入8×104個細胞/mL的細胞懸液于96孔板中，而空白組中用DMEM高糖培養(yǎng)基代替細胞懸液，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，實驗組中加入100 μL 不同濃度（0~80 μg/mL）的CUR/CDP，而空白組和陰性對照組中均分別加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后，采用移液器抽掉培養(yǎng)基。然后，實驗組中加入200 μL 600 mmol/L乙醇，而空白組和陰性對照組中均分別加入200 μL DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液孵育4 h。然后，采用注射器抽掉上清液，加入150 μL DMSO溶液反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀測量各個孔在570 nm處的吸光值。根據(jù)式（1）計算細胞存活率。

1.2.5 CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷后ALT、AST、LDH、SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影響 將LO2細胞懸液以2×105個細胞/mL的密度接種于無菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿添加5 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的CUR/CDP培養(yǎng)12 h后去除培養(yǎng)液，加入5 mL 600 mmol/L乙醇培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)液收集于離心管中。根據(jù)ALT、AST和LDH試劑盒的操作方法檢測細胞培養(yǎng)液中ALT、AST和LDH活力。并根據(jù)SOD、GSHPX和MDA試劑盒的操作方法檢測細胞內(nèi)的SOD、GSH-PX活力和MDA含量。

1.2.6 CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷后ROS含量的影響 將LO2細胞以8×104個細胞/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，分別加入100 μL不同濃度的CUR/CDP培養(yǎng)12 h后用移液器去除培養(yǎng)液，加入200 μL 600 mmol/L乙醇培養(yǎng)6 h后，加入300 μL DCFH-DA孵育30 min。用PBS洗滌3次，采用酶標(biāo)儀測量各個孔在激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為525 nm條件下的熒光強度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準差（x ˉ±s）表示。實驗結(jié)果采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用T檢驗對兩組之間的數(shù)據(jù)進行比較，P<0.05為差異具有顯著意義，P<0.01為差異具有極限顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LO2細胞損傷模型的建立

由圖1可知，細胞經(jīng)不同濃度的乙醇處理6 h后，細胞存活率隨著乙醇濃度的升高呈下降趨勢。當(dāng)乙醇濃度為600 mmol/L時，細胞存活率從對照組的100%±6.57%下降至54.79%±4.41%（P<0.05），為中度損傷。故選擇此濃度進行后續(xù)實驗。

圖 1 不同濃度的乙醇對LO2細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different ethanol concentrations on the cell viability of LO2 cells

2.2 CUR/CDP對乙醇損傷LO2細胞存活率的影響

由圖2可知，當(dāng)80 μg/mL CUR/CDP對細胞進行單獨處理后，細胞存活率從陰性對照組的100%下降到89.61%±1.87%，表現(xiàn)出輕微的細胞毒性。然而，相比600 mmol/L乙醇單獨處理的模型對照組，當(dāng)細胞經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP處理后，可以顯著提高細胞經(jīng)乙醇處理后的細胞存活率（P<0.05），且呈現(xiàn)出對包合物濃度的依賴性。當(dāng)CUR/CDP濃度達到80 μg/mL時，細胞存活率從54.75%±8.97%（模型對照組）提高到85.27%±2.64%，表明CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)細胞損傷具有保護作用，這可能是由于CUR/CDP的抗氧化活性降低了乙醇誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而起到保護肝細胞損傷的作用。

圖 2 CUR/CDP對乙醇損傷LO2細胞存活率的影響Fig.2 Effects of CUR/CDP on the cell viability of LO2 cells injured by ethanol

2.3 CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷后ALT、AST和LDH活力的影響

由表1可知，與陰性對照組相比，模型對照組中的ALT、AST和LDH活力極顯著上升（P<0.01）；相比模型對照組，細胞經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP處理后，能降低ALT、AST和LDH活力，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。當(dāng)CUR/CDP的濃度達到80 μg/mL時，ALT、AST和LDH活力從模型組的（26.47±0.90）、（41.02±4.41）和（63.77±4.95）U/L降至（16.17±0.42）、（22.62±0.79）和（32.25±1.69）U/L。這可能是由于CUR/CDP的抗氧化活性避免了細胞因ROS含量的升高導(dǎo)致其細胞膜破損引發(fā)細胞內(nèi)ALT、AST和LDH的釋放，使得細胞外ALT、AST和LDH活力相應(yīng)降低。

2.4 CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷后SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影響

由表2可知，與陰性對照組相比，模型對照組中的SOD和GSH-PX活力極顯著降低，而MDA的含量極顯著上升（P<0.01）；相比模型對照組，細胞經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP處理后，能升高SOD、GSH-PX活力和降低MDA的含量，并且表現(xiàn)出濃度依賴性。當(dāng)CUR/CDP濃度達到80 μg/mL時，SOD、GSH-PX活力從模型組的（8.45±1.11）、（21.82±1.34）U/mg prot增至（16.47±1.27）、（36.70±0.56）U/mg prot，而MDA含量從模型組的（1.19±0.15）nmol/mg prot降低到（0.72±0.05）nmol/mg prot。這可能是由于CUR/CDP處理細胞后，其抗氧化作用提高了細胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-PX的活力，從而清除了細胞內(nèi)乙醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，進而降低了MDA的含量。

2.5 CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷后活性氧（ROS）含量的影響

由圖3可知，與陰性對照組相比，模型對照組中ROS含量極顯著上升（P<0.01）；而經(jīng)CUR/CDP處理后，能明顯降低細胞內(nèi)ROS含量，當(dāng)CUR/CDP濃度達到80 μg/mL時，ROS含量從模型對照組198.02%±11.76%降低到110.87%±10.22%。實驗結(jié)果表明，CUR/CDP是通過降低ROS含量來減輕乙醇誘導(dǎo)LO2細胞的損傷。這可能是由于細胞經(jīng)CUR/CDP預(yù)處理后，其抗氧化作用能夠有效清除細胞內(nèi)的自由基使得細胞內(nèi)ROS的含量降低，達到保護細胞的目的。

表 1 CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷后ALT、AST和LDH活力的影響Table 1 Effects of CUR/CDP on the activities of ALT, AST and LDH in the culture medium of LO2 cells damaged by ethanol

表 2 CUR/CDP對乙醇損傷LO2細胞中SOD活力、GSH-PX活力和MDA含量的影響Table 2 Effects of CUR/CDP on SOD activity, GSH-PX activity and MDA contents in LO2 cells damaged by ethanol

圖 3 CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷后ROS含量的影響Fig.3 Effects of CUR/CDP on ROS content in LO2 cells damaged by ethanol

3 討論

盡管目前有文獻報道酒精性肝損傷的相關(guān)發(fā)病機制，但其具體的發(fā)病機理尚無定論。有研究認為，酒精代謝產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)等與酒精性肝損傷有關(guān)。長期或過量攝入酒精會使酒精在肝臟的代謝過程中抑制線粒體中乙醛的氧化反應(yīng)，造成酒精代謝產(chǎn)物乙醛在肝臟中不斷地積累[15]。肝臟中積累的乙醛會破壞肝細胞的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、損傷線粒體、影響肝臟的微管系統(tǒng)、引起肝纖維化等，從而導(dǎo)致肝損傷[16]。而且，機體內(nèi)過量的酒精會在肝臟中發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致機體產(chǎn)生大量的活性氧，同時也會造成谷胱甘肽等抗氧化物質(zhì)含量顯著降低，從而導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)遭到破壞，最終引起肝臟損傷[17]。

在正常情況下，ALT、AST和LDH主要存在于肝細胞中，當(dāng)肝細胞受到損傷時，ALT、AST和LDH會被釋放到培養(yǎng)液中，使得細胞培養(yǎng)液中的ALT、AST和LDH含量顯著升高，故通過檢測培養(yǎng)液中ALT、AST和LDH的含量可反映出肝細胞的受損程度[3,18?19]。在本研究中，經(jīng)過乙醇損傷后LO2細胞培養(yǎng)液中ALT、AST和LDH活力極顯著升高（P<0.01），這說明乙醇破壞了LO2細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)，對LO2細胞造成了一定程度的損傷。經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP預(yù)處理后，LO2細胞培養(yǎng)液中ALT、AST和LDH活力隨著CUR/CDP濃度的升高逐漸降低，這說明CUR/CDP對LO2細胞具有保護其細胞膜結(jié)構(gòu)的能力。

MDA是細胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)后的主要產(chǎn)物，細胞內(nèi)MDA的含量反映了細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[20]。GSH-PX是細胞內(nèi)的一種過氧化物酶，能夠清除細胞內(nèi)發(fā)生了氧化反應(yīng)的脂質(zhì)[21]。SOD是機體防御細胞發(fā)生氧化反應(yīng)的首要防線，能夠快速地清除氧自由基，防止機體受到損傷[22?23]。當(dāng)細胞受到損傷時，細胞內(nèi)的GSH-PX和SOD可以通過清除細胞內(nèi)被氧化的脂質(zhì)以及氧自由基來維持細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而達到保護細胞的作用。在本研究中，經(jīng)乙醇損傷后，細胞內(nèi)GSH-PX活力和SOD的活力出現(xiàn)極顯著降低（P<0.01），MDA的含量極顯著上升（P<0.01），這說明乙醇破壞了細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，使得細胞受到損傷。當(dāng)LO2細胞經(jīng)CUR/CDP預(yù)處理后，細胞內(nèi)GSH-PX活力和SOD活力明顯恢復(fù)，MDA含量明顯降低，表明CUR/CDP能夠改善乙醇對細胞造成的損傷。

乙醇在肝臟中會被細胞色素P450（CYP2E1）氧化，此過程會產(chǎn)生過量的活性氧（ROS），而ROS是細胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)發(fā)生的重要因素之一[24]。當(dāng)肝臟受到過量乙醇刺激時，肝細胞內(nèi)ROS的含量會顯著增加，從而導(dǎo)致肝損傷[25?27]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP處理乙醇誘導(dǎo)的細胞后，細胞內(nèi)ROS含量隨著CUR/CDP濃度的增加呈降低趨勢，表明，CUR/CDP能夠抑制乙醇誘導(dǎo)細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而達到保護細胞的目的。

4 結(jié)論

本文通過建立乙醇誘導(dǎo)肝細胞損傷模型和采用ALT、AST、LDH、SOD、GSH-PX、MDA和ROS試劑盒檢測CUR/CDP對乙醇誘導(dǎo)細胞損傷后其相關(guān)酶活性和MDA、ROS含量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，CUR/CDP能夠降低ALT、AST、LDH、MDA和ROS的含量，同時也能恢復(fù)SOD和GSH-PX的活力，這表明CUR/CDP通過提高細胞內(nèi)抗氧化酶的活力以及降低MDA和ROS含量來達到保護細胞的目的。綜上所述，姜黃素超分子包合物具有改善乙醇誘導(dǎo)LO2細胞損傷的能力，為其今后在肝損傷領(lǐng)域和預(yù)防肝癌等臨床的應(yīng)用與開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。