生物傳感器檢測食物過敏原的研究進展

葉 茂，李 欣，武 涌，陳紅兵，高金燕，文學方

（1.南昌大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047；2.南昌大學食品學院，江西南昌 330047；3.南昌大學，中德聯合研究院，江西南昌 330047；4.江西省科學院，應用化學研究所，江西南昌 330096）

食物過敏是由于機體攝入某些特定食物蛋白引發的不良免疫反應，臨床上屬于變態反應[1?2]。它影響全世界5%的成人和8%的兒童。食物過敏原通常是水溶性或鹽溶性糖蛋白。目前，已有來自123個物種的358個蛋白被鑒定為食物過敏原[3]，根據過敏原的一級結構、交叉反應性和相似的生物學功能分為不同的家族，表1列出了部分重要的植物源性和動物源性的過敏原家族。攝入過敏原較短的時間內，患者會出現明顯的過敏癥狀，如皮膚紅疹、呼吸困難、消化不良、腹痛等，也可能出現嚴重的全身性過敏反應[4?5]，但至今仍沒有對食物過敏有效的治療手段[6]，唯一的辦法就是采取一定的措施使過敏患者避免攝入含有過敏原的食物。2012年，我國實施《預包裝食品標簽通則》（GB7718-2011），鼓勵企業自愿標示過敏原成分以保護消費者，但由于制造商對過敏原標簽法意識缺乏，食物中出現未標注的過敏原成分的情況仍時有發生，這對過敏患者來說是一個巨大的隱患，也是形成進出口貿易壁壘的原因之一[7]，故開發快速、靈敏、可重現和標準化的檢測方法對食物過敏的預防和控制具備重大意義[5?6]。

生物傳感器作為一類新興的檢測方法，具有快速、高靈敏度、高度自動化、實時監控等優點，近年來被廣泛用于農藥殘留、病原微生物以及食物過敏原等方面的檢測[8–10]。它主要通過生物識別元件對食物中的過敏原識別并產生響應，再由換能器轉化為可定量的光電信號來實現檢測。本文從原理、優缺點和應用等方面對國內外用于檢測食物過敏原的生物傳感器方法進行了闡述和總結，并進一步指出目前生物傳感器在食物過敏原檢測方面存在的不足之處以及今后的發展方向，為食物過敏原快速檢測方法的建立提供參考。

1 食物過敏原檢測方法

食物過敏原傳統/標準的檢測方法主要分為以下三類：分子生物學檢測方法，這類方法通過對過敏食物特異性DNA進行擴增來實現[11–13]，如環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、實時熒光定量PCR技術等。由于DNA在熱處理和高壓下保持較長時間的完整性，所以該方法比較穩定、自動化程度高，但不能檢測特定的過敏原蛋白，只能瞄準其表達的特征DNA片段，DNA含量與蛋白含量沒有量效關系，且蛋白才是主要導致過敏的“元兇”，所以PCR技術適合檢測核酸含量高的樣品，如花生、堅果、大豆、魚和甲殼等[13?15]；免疫學檢測方法，該類方法基于抗原抗體之間的特異性結合，如酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫印跡等，其中ELISA法是應用范圍最廣的檢測方法[16–18]，其具備特異性強、靈敏度高、適合大批量樣本檢測等優點，但由于食品加工方法、人員操作和實驗試劑的影響，ELISA容易出現假陽性或假陰性結果、可重復性差；色譜學檢測方法，如液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatography-mass spectrograph，LC-MS/MS）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等[19–22]，其中LC-MS/MS法是我國于2019年實施的推薦性國家標準GB/T 38163-2019中規定的方法，可對牛奶、雞蛋、大豆等食品中的部分過敏原進行檢測。該法通過對過敏原的特征肽段進行鑒定來明確識別過敏原，但不適用于實時分析且設備的高昂成本可能會限制其在食品工業中的廣泛應用。以上三類方法已經過幾十年的發展，具有一定的優越性，同時也存在局限性，如需專業人士操作、難以現場化常規化檢測等，而生物傳感器作為一類近年來發展起來的方法，具有響應快速、高度自動化、部分傳感器支持現場檢測等優點，已成為熱點研究的領域，在食物過敏原快速檢測上十分具有潛力。

表 1 常見的食物過敏原及其家族[5]Table 1 Examples of major class food allergens[5]

2 生物傳感器的原理及其應用

生物傳感器由生物識別元件、換能器和光電信號放大裝置等部分組成（圖1）。生物識別元件是精確捕獲目標物質的關鍵，不同的生物分子（如抗體、細胞等）和仿生分子（如適配體）都可用作過敏原的生物識別元件（圖2）。當生物識別元件與待測樣品相互作用產生化學信號，換能器將其轉換為可定量檢測的光電信號，再經過分析系統進行放大，從而對待測物定性及定量分析[22?24]。其中，換能器是生物傳感器至關重要的組成部分，也是20世紀90年代以來許多團隊想要突破和創新的地方[25]。本文根據換能器的種類，將生物傳感器分為光學生物傳感器、電化學生物傳感器及壓電免疫生物傳感器進行介紹，并在表2中總結了不同類型的生物傳感器的基本原理及優缺點，表3列舉了用于檢測牛乳過敏原β-乳球蛋白的光學生物傳感器和電化學生物傳感器的研究實例，可以更加清晰直觀地比較各類傳感器的差異。

圖 1 生物傳感器工作原理Fig.1 Working principle of biosensor

圖 2 生物識別元件與受體結合示意圖Fig.2 Schematic diagram of the binding of biological recognition element and receptor

2.1 光學生物傳感器

光學生物傳感器通過識別待測物與生物受體相互作用后對光學結構表面的有效折射率、熒光或者顏色等的變化實現待測物的檢測[39–41]，依據檢測信號的不同分為以下三類：共振增強吸收（resonance enhanced absorption，REA）、熒光、表面等離子共振（surfaceplasmon resonance，SPR）[28?29]。表4中列舉了基于REA、熒光、SPR光學傳感器的基本原理及優缺點。這三類傳感器都具備響應速度快、無需標識且光學元件抗干擾能力強等優點，但REA生物傳感器制作工藝復雜，熒光生物傳感器雖靈敏度高但不適合現場檢測，SPR生物傳感器檢測限相對較低。此外，大多數光學傳感器的檢測都需要二次再檢測。

2.1.1 基于REA的光學生物傳感器 當抗原與金簇抗體在免疫芯片的光學透明距離層的表面上結合時，金納米粒子沉積在反射鏡上方的光學近場中，產生了共振增強吸收現象，通過光學傳感器可觀察到強烈的顏色效應[42]。REA生物傳感器與納米金屬探針聯用可以得到更強的REA信號，其具有操作簡單、無損傷分析等優點，但僅有極少的貴金屬粗糙面才具有共振增強現象，且其制作工藝復雜難以標準化，重復性較差。Hohensinner等[29]研制了一種基于REA的新型光學生物傳感器，用金簇標記的抗β-乳球蛋白抗體與過敏原結合，建立了在奶粉中檢測β-乳球蛋白的方法。Maier等[42]將過敏原涂覆在芯片上，去捕獲金納米粒子標記的抗體，實現了卵清蛋白和卵類粘蛋白的檢測，檢測限（limit of detection，LOD）為1 ng/mL。隨后，其又研制了一款基于REA的光學生物傳感器去檢測經熱處理后的β-乳球蛋白的致敏性，結果顯示β-乳球蛋白和抗體結合能力在95 ℃處理20 min和90 ℃處理60 min后仍未喪失，但抗原性降低[30]。

2.1.2 基于熒光的光學生物傳感器 通過熒光信號分子與待測物結合時，熒光團內在的光物理特性被激活，進而釋放出熒光信號，根據熒光強度的變化對待測物中的過敏原含量進行檢測[43]，其具有分析時間短、靈敏度高等優點，但熒光信號分子的熒光壽命以秒為單位，并且需要特定的儲存條件，不適合現場檢測。Jiang等[44]開發了以大鼠肥大細胞（RBL-2H3）為傳感介質的熒光傳感器，來鑒定和檢測魚類過敏原小清蛋白（parvalbumin，PV）。通過高效的脂質介導的DNA轉染程序，將增強型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）質粒導入肥大細胞中以獲得穩定表達綠色熒光的RBL-2H3肥大細胞株，再使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察RBL-2H3細胞受過敏原刺激后的熒光強度變化。該法的線性范圍為1~100 ng/mL，LOD為0.35 ng/mL。álvarez等[32]用鏈霉親和素包裹的量子點（quantum dots，QDs）標記二抗來放大信號，并通過熒光傳感器檢測β-乳球蛋白，LOD為33.7 ng/mL。Chen等[45]使用指數富集的配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選出了乳鐵蛋白的兩個裂解適配體，將它們的結構優化成一種新型的雙結合位點分裂適配體，再將二價適配體分別與信號分子異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）和納米粒子Ag10連接，最后基于熒光偏振法（fluorescence polarization，FP）的光學傳感器檢測奶粉中乳鐵蛋白。通過使用了適配體和Ag10，大大提升了傳感器的靈敏度，比傳統的光學傳感器高3個數量級，LOD為0.02 ng/mL。隨后，Shi等[35]也將一種新型的熒光納米材料碳點（carbon dots）與適配體相結合，成功建立了低致敏配方乳制品中β-乳球蛋白的檢測方法，該方法的LOD為0.037 ng/mL。最近，Phadke等[46]利用核糖體展示技術篩選出兩個抗αs-酪蛋白熒光肽適配體Cas1和Cas2，通過PEG24在Cas1的N端進行修飾，可以抑制β-乳球蛋白的熒光，同時增強αs-酪蛋白存在下的熒光，LOD為1008 ng/mL，與免疫層析試劑盒所需的15 min相比，基于熒光肽適配體傳感器的檢測時間僅要20~25 s，熒光適配體具有更加顯著的識別能力和潛在的應用前景。

表 2 檢測食物過敏原的生物傳感器的基本原理及優缺點Table 2 Pros cons and principles of various biosensors for detection of food allergens

表 3 生物傳感器在牛乳過敏原β-乳球蛋白檢測中的應用Table 3 Application of biosensors in the detection of milk allergen β-lactoglobulin

表 4 檢測食物過敏原的光學傳感器的基本原理及優缺點Table 4 Pros cons and principles of optical biosensors for detection of food allergens

2.1.3 基于SPR的光學生物傳感器 當消逝波穿過金屬薄膜時，金屬薄膜表面固定生物識別元件與其表面捕獲的食物過敏原的界面處發生表面等離子體共振（SPR）現象，傳感器實時記錄光折射率的變化，通過判斷食物過敏原與其受體的吸附和解離情況來定量食物過敏原（圖3）[47?52]。目前，表面等離子體共振（SPR）生物傳感已被開發用于蛋白質濃度的測定，它對食物過敏原、有毒蛋白質、抗體和藥物蛋白質等具有極高的敏感性、無需標識、能輕松地監控各種生物分子相互識別的實時變化，但靈敏度不高，檢測限偏低[53?54]。Billakanti等[31]開發了基于SPR生物傳感器定量測定加工過的牛乳樣品、乳清餾分和各種奶源產品中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、乳鐵蛋白和IgG的方法，平均含量為8.0×105、4.0×106、2.1×105、1.2×105和4.8×105ng/mL，且與HPLC測出的結果之間的決定系數R2>0.97，但存在靈敏度低的缺點，需要提升傳感器的性能。于是，Pollet等[50]將磁性納米顆粒與光纖平臺結合到一起，通過磁性納米顆粒增強傳感信號，利用光纖SPR傳感器快速準確地檢測花生過敏原Ara h 1，將LOD提高兩個數量級，為90 ng/mL。Angelopoulou等[51]將微流控芯片與SPR光學傳感器結合，既可以縮短反應時間，又能減少樣品消耗。通過電動傳輸樣品并引導樣品到特定的位置，可同時檢測酪蛋白、花生蛋白、大豆蛋白和醇溶蛋白四種不同食物過敏原，檢測時間為6.5 min，LOD分別為40、1.0×103、800和100 ng/mL，與ELISA檢測結果一致，且成本更低。最近，Zhou等[47]研制了一款檢測原肌球蛋白（tropomyosin，TM）的傳感器，將抗TM的單克隆抗體修飾在金標生物芯片表面，通過SPR傳感器進行定量檢測，該方法檢測十分迅速，僅需3 min即可準確檢測出不同貝類中TM的含量。

圖 3 基于SPR生物傳感器的食物過敏原實時定量檢測工作原理[47]Fig.3 Principle of an SPR biosensor for food allergen real-time detection[47]

2.2 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器將生物識別元件固定在電極表面，與識別到的待測物結合，從而引起電極上的電阻、電勢或電流等的變化，進而實現待測物的檢測[51?52]，根據最終檢測信號的不同大致可分為阻抗法、安培法和伏安法[53-54]。表5中列舉了基于阻抗法、安培法和伏安法電化學傳感器的基本原理及優缺點，其具有預處理過程簡單、成本低、靈敏度高、便攜、易于操作、適用于現場應用等優點，但重復性不好、電極表面易鈍化和待測樣本受表面電活性物質干擾等缺點。電化學生物傳感器對成分復雜以及帶有顏色的樣品的檢測尤其適用，被認為是最有前途的分析工具之一[54?55]。

2.2.1 阻抗法 阻抗法電化學生物傳感器是將生物識別元件固定在電極表面，當其與待測物結合時，引起電極表面阻抗值的變化來測定目標物[56–57]。這類傳感器的制備過程簡易，穩定性好，由于方法學的限制，它不能同時對多種物質同時進行分析。阻抗測量常分為兩種：非法拉第阻抗和法拉第阻抗，前者可以在沒有氧化還原對存在的情況下進行檢測，在電化學生物傳感器中應用較少，后者必須在有氧化還原對存在下才能測定。電化學阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）是法拉第阻抗，它通過測定固體電解質的電導率、電極表面的電子傳遞阻抗等，從而獲得生物分子之間相互作用的結果。Sun等[40]以花生過敏原Ara h 1寡核苷酸為探針，探針的5′端用硫醇標記，3′端用生物素標記，通過硫醇親和力形成莖環結構，將探針連接到金電極表面來改良阻抗型電化學DNA傳感器的靈敏度和選擇性，同時用EIS測量了探針與電極之間電子轉移效率的變化，該法LOD為2.22×10?5ng/mL。Jiang等[28]將肥大細胞與阻抗型電化學傳感器結合，通過模擬過敏原在體內細胞中的生理效應來實現過敏原的檢測。肥大細胞的表面有大量Fc受體，可以選擇性結合IgE或IgG抗體，當它與致敏原相結合后將觸發脫顆粒，引起組胺、5-羥色胺和β-己糖胺酶等化學介質的釋放，從而轉化為可以很容易記錄和量化的信號。該課題組通過此方法構建了檢測河蝦原肌球蛋白Pen a 1的方法，該法的LOD為150 ng/mL。隨后，研究者們又結合微流控芯片技術及巨噬細胞和肥大細胞共培養系統，實現了同時進行微流控細胞培養、食物過敏原誘導的細胞形態變化和高通量過敏原的分析測定[58]。

2.2.2 安培法 安培法電化學生物傳感器是當工作電極的電位恒定時，待測物在電極表面或其修飾層內發生氧化還原反應，產生的電流隨時間的變化來定量分析反應中的電活性物質[59]。這類傳感器因為其電極的輸出信號直接和待測物的濃度呈線性關系，成為研究最多、應用最廣的一類電化學傳感器，但重復性差。Sun等[60]制備了電化學DNA傳感器檢測花生過敏原Ara h 1，用安培法監測DNA雜交，通過在電極上涂覆一層殼聚糖-多壁碳納米管復合材料和酶聯放大生物分子的電化學反應活性，以此來提高靈敏度，增大動態監測范圍，該法LOD為8.26×10?7ng/mL，線性范圍為2.48×10?6~7.94×10?5ng/mL。Ruiz-Valdepe?as等[61]使用羧酸修飾的磁珠固定酶標記的抗體，用安培法電化學免疫傳感器檢測α-乳白蛋白，其LOD達到0.011 ng/mL。Angulo-Ibá?ez等[62]首次開發了一款基于磁珠修飾捕獲抗體的夾心安培型電化學傳感器去檢測蝦TM。通過磁珠修飾捕獲抗體，可以使用外部磁鐵進行快速和簡單的分離，從而減少分析時間，提高在樣本中捕獲TM的效率，最大限度地減少了基質效應[63]，其LOD為0.0469 ng/mL。該傳感器簡化了樣品制備過程，無需純化或濃縮階段，可直接在食品工業中進行現場常規過敏原分析。

2.2.3 伏安法 伏安法電化學生物傳感器是通過將生物識別元件固定在電極表面，目標物質與之結合后引起電極表面電活性物質發生改變，根據峰電流強度和濃度的關系準確定量，濃度越高，峰電流越大[37]。它具有制作簡單、穩定性好、重復性好、可同時分析多種分析物，但靈敏度較阻抗法偏低。Cao等[64]利用聚-L-精氨酸/多壁碳納米管（P-L-Arg/MWCNTs）復合膜對玻碳電極進行改性，通過納米金（AuNPs）來修飾電極來促進電子轉移、提高電極電導率和結合位點，進而放大反應[65]。該團隊建立了一種基于循環伏安法（cyclic voltammetry，CV）和差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）電化學傳感器檢測牛乳中酪蛋白的方法，線性范圍為102~104ng/mL，LOD為50 ng/mL。López等[66]研制了一種響應面分析法與DPV電化學傳感器結合檢測Ara h 2的方法。通過響應面分析法優化了捕獲探針和巰基己醇（間隔物）的濃度，使得傳感器的分析性能得到了提升，LOD為0.17 ng/mL。Alves等[67]通過兩種單克隆抗體來建立夾心型伏安法電化學傳感器用于檢測食品中的Ara h 6，其線性范圍為1~100 ng/mL，LOD為0.27 ng/mL，該法被應用于復雜食品基質如餅干和巧克力中Ara h 6的檢測。隨后，Kokkinos等[68]開發了一種基于量子點的競爭性伏安法傳感器用來檢測酪蛋白和免疫球蛋白G（IgG）。該方法的線性范圍分別為0~5×103和0~2×103ng/mL，LOD分別為20和40 ng/mL，該法被應用于牛乳摻假問題的檢驗。

表 5 檢測食物過敏原的電化學傳感器的基本原理及優缺點Table 5 Basic principle, advantages and disadvantages of electrochemical biosensors for detection of food allergens

2.3 壓電免疫傳感器

壓電免疫生物傳感器通常將抗體固定在晶體表面，壓電晶體在振蕩時存在一個基礎頻率，當抗原抗體結合時，質量增加，晶片的振蕩頻率會相應減少，通過減少值與吸附量之間的相關性對待測物進行定量分析[69]。它的優點是重復性好、檢測時間短、無需標識即可實現免疫檢測，可用于表征生物分子相互作用。石英晶體是最為常用的壓電晶體，Sun等[70]首次將基于石英晶體微天平（quartzcrystalmicrobalance，QCM）的壓電免疫傳感器檢測蝦過敏原Pen 1；觀察傳感器表面特異性抗體結合時的振動變化，其LOD為333 ng/mL，檢測時間僅需10 min，可重復使用13次以上。Chu等[71]將金納米粒子（AuNPs）固定在QCM電極表面，再將雞抗醇溶蛋白抗體直接固定在AuNPs修飾的表面，通過壓電免疫傳感器檢測醇溶蛋白與抗體結合時頻率的變化，該方法的靈敏度大為提 高，LOD為8 ng/mL。隨 后，Funari等[72]將QCM傳感器與光子固定技術相結合檢測食品中的醇溶蛋白，這種技術通過紫外線照射選擇性還原蛋白質中的二硫鍵，把抗體定向固定在QCM表面上，10 min內即可完成對實際樣品中提取物的分析，該法的LOD為4×103ng/mL。

3 結論與展望

食物過敏原的檢測與食品生產、標識及風險管理等息息相關，是確保食品安全的關鍵環節之一，且微量的過敏原即可引發食物過敏反應，因此高靈敏度和低檢出限的生物傳感器非常適合用于食物過敏原的檢測。本文論述了光學、電化學和壓電免疫生物傳感器在檢測食物過敏原的最新進展，基于目前檢測食物過敏原的生物傳感器所存在的缺陷，未來的改進方向主要集中在以下幾個方面：食品樣本基質效應大，如何從包含大量干擾成分的復雜食品基質中成功提取目的過敏蛋白，避免假陽性和假陰性結果，是樣本制備的挑戰之一；雖然便攜式食品評估技術越來越熱門，但是目前大多數生物傳感器檢測平臺仍依賴于實驗室，若能將智能手機作為傳感器的現場控制或者分析工具，開發強大的智能手機應用程序，提供快速傳輸和數據存儲功能，將大大提高生物傳感器的便攜性和可操作性；當前大部分的生物傳感器中生物識別元件僅能識別一到兩種過敏原，而實際生產中需要同時對多種過敏原進行檢測，高通量快速檢測是生物傳感器發展的重要方向之一；由于納米材料（如金納米粒子、量子點和石墨烯等）具有放大信號、易于分離和良好的生物相容性等優點，在生物傳感器中廣泛使用以提升性能，如何進一步探索開發新型納米材料用于超靈敏檢測食物過敏原也是十分有必要的；強效有毒的化學物質作為固定材料會限制部分生物傳感器的產業化應用，尋找天然材料部分或完全替代這些有毒化學物質且滿足檢測要求是一個可行的改進方向，如加強天然橡膠、硬明膠膠囊和玉米醇溶蛋白等材料等在其中的應用。

生物傳感器檢測是一類多學科交叉融合的新興技術，它的易操作、響應快速及樣品用量少等特性仍具有較大的優勢。可以預見，研發出微型、智能、環保和高通量的生物傳感器來監控食品加工過程中的過敏原交叉污染，能夠幫助食品生產企業、食品加工商和食品安全監管部門，保護消費者權益，為快速現場定量檢測食品中的過敏原提供可靠的分析方法，具有很好的應用前景。