膝骨關節炎中醫證候動物模型的研究進展

楊威 郭斯印 易志勇

【摘 要】 膝骨關節炎基本中醫證型是腎陽虛證、氣滯血瘀證和寒濕阻滯證，中醫證候動物模型以腎陽虛模型、血瘀模型和寒濕模型為主。腎陽虛證模型是研究最早的中醫證候動物模型，造模方法種類繁多，包括西醫病理造模和中醫病因造模，但兩者都存在不足，所以病證結合模型備受關注。科學評價病證結合模型，應采集動物“四診信息”，結合基因組學、代謝組學和蛋白組學等，宏觀微觀綜合評價，必要時運用經典方劑佐證。

【關鍵詞】 膝骨關節炎;動物模型;中醫證型;病證結合;研究進展;綜述

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性進行性骨關節疾病，基本病理改變為軟骨變性和丟失、滑膜肥厚及關節邊緣和軟骨下骨質再生，多發于膝稱為膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）[1-3]。

隨著人民生活水平的提高，預期壽命的延長，KOA的發病率逐年增高[4]，國外也有相關報道[5]。KOA臨床表現為慢性關節活動痛、僵硬，嚴重者關節畸形甚至癱瘓，盡管最新臨床和實驗研究認為未變性的Ⅱ型膠原有利于KOA患者[6]，但目前病因病機不明，仍缺乏有效的治療手段[3，7]。而動物實驗是人們深入認識KOA發病機制和探索有效治療手段的重要途徑[8-11]。

中醫藥通過減輕KOA患者疼痛、改善關節功能和調節整體生理功能進而提高患者生活質量。KOA屬中醫學“膝痹”范疇，病因病機為“本痿標痹、本虛標實”。肝腎虧虛，筋骨失養為本痿;邪氣痹阻，經絡不暢為標痹[12-13]。本病大致可分為氣滯血瘀證、寒濕痹阻證和肝腎虧虛證，分別對應血瘀、寒濕和腎陽虛型造模。為進一步探究其發病機制，就此做一簡要綜述。

1 動物的選擇

OA的動物造模，最常復制膝關節，還包括髖關節、掌指關節和顳下頜關節[14]等。按照體積大小可以將KOA模型動物分為小型、較大型和靈長類，小型動物包括鼠類和兔等，大型動物包括羊、小豬和馬等，靈長類動物有狒狒、獼猴和黑猩猩等。動物的選擇應當考慮以下幾點因素：實驗目的、類型、時間長短、飼養花費、操作難易和結果檢測等。時間長短要考慮每種動物骨骼成熟時間和發展為KOA的進程[15]。小動物主要用于研究疾病進展的病機和病理生理學特點，也用于對藥物干預的首次篩查研究。小動物模型相對經濟、快捷，缺點是與人類在解剖學、組織學和生理學等方面差異很大，在藥物研究方面不能直接等效地推論到人類。例如，小鼠關節軟骨的平均厚度是人類的1/70[16]。靈長類動物在生物學和行為學上與人類相似，其原發性KOA的發展和人類很相似[17]，而且創傷引起的應激障礙和抑郁癥基本與人類一樣[18]，但花費高。

2 KOA的西醫病理學造模概述

KOA按病因分為原發性和繼發性[15]，繼發性包括創傷后、廢用性和繼發于其他系統性疾病的KOA，常以前兩者進行動物模擬。對應經典的造模方式是人工誘導和自發造模，人工誘導包括關節制動、侵入性和非侵入性模型，侵入性模型主要是手術誘導和化學生物誘導，手術誘導包括關節內手術和關節外手術，關節內手術指破壞關節韌帶、半月板、軟骨、滑膜和植入異物等，關節外手術包括破壞關節周圍肌肉、韌帶、血管和切除卵巢等;非侵入性包括過關節撞擊、關節內脛骨平臺骨折、周期性脛骨平臺軟骨受壓和脛骨過度負載等[19-20]。西醫病理學造模方法繁多，還有一些創新的、少數人使用的造模方法未提及，每種具體的造模方式都有其優缺點，需要根據其特有的致病機制、病理變化特點以及自身需求選擇合適的KOA模型。

3 KOA的中醫證型造模

多數學者將KOA證型大致概括為正虛、邪實和虛實夾雜證。李具寶等[21]通過比較近10年文獻中KOA患者內服方藥，認為其對應的中醫證型為虛證、實證和虛實夾雜證，虛證主要分為肝腎虧虛證、腎虛髓虧證、脾腎虧虛證等，實證主要有寒濕痹阻證、氣滯血瘀證、濕熱壅盛證、筋脈瘀滯證、風濕痹阻證等，虛實夾雜證包括陽虛寒凝證和氣虛濕阻證。高玉花[22]通過檢索與KOA證型相關的文獻并對144例符合標準的女性患者進行回顧性研究，發現其基本證型是氣血瘀滯證、肝腎不足證、脾腎陽虛證和寒濕痹阻證。胡彬等[23]采用KOA臨床證候調查表，并運用對應分析和二步聚類分析得出3種主要證型，分別是腎虛髓虧型（50.5%）、陽虛寒凝型（3.5%）、瘀血阻滯型（23.0%）。何峰等[24]在對200例KOA患者辨證治療研究中，將其進一步分為肝腎虧虛證、氣滯血瘀證和寒濕痹阻證3種證型。因此，對應臨床主要證型，目前動物實驗也以腎陽虛、血瘀和寒濕模型為主。

3.1 腎陽虛模型 腎陽虛證模型是研究最早的中醫證候動物模型，已有50多年歷史，是連接西醫基礎和中醫臨床的樞紐，可深化對中醫證候的認識，有利于中醫藥現代化發展[25]，簡要概括當前動物造模方法，按照機制大致可分為西醫病理學造模和中醫病因學造模，且以前者多見。

3.1.1 西醫病理學造模 沈自尹等[26-27]經過大量動物研究認為，下丘腦細胞損害及其引起的功能紊亂是腎陽虛證的主要病理基礎，下丘腦受損導致下丘腦-垂體-腎上腺、甲狀腺、性腺軸功能紊亂，繼而其支配的代謝和免疫器官出現相應的功能失常或結構病理改變。進一步以藥測證研究中采用基因芯片技術發現，腎虛證大鼠模型存在神經-內分泌-免疫和神經-內分泌-骨代謝兩大基因調控路線紊亂[27]。西醫病理學造模可分為腎上腺皮質、甲狀腺和性腺功能抑制模型，DNA合成抑制腎陽虛模型和其他病理模型。

臨床研究結果表明，腎陽虛證的表現與腎上腺皮質功能低下緊密相關[28]。腎上腺皮質功能抑制模型可分為糖皮質激素應用法，氨基導眠能灌胃法和腎上腺切除術。最早和最常用的是糖皮質激素法，大量文獻表明，糖皮質激素藥物種類繁多，造模時給藥途徑、劑量、給藥時間、持續時間和動物選擇等都有所差異，其中國內外最認可的方式是將氫化可的松注射液以10 mg·kg-1·d-1的劑量注射到成年大鼠腹腔，持續15 d即可成模[29]。其次是去勢法。切除動物雙側睪丸或卵巢[30]，可成功模擬腎陽虛證。但也有研究認為，此法不僅創傷大且性腺軸的反饋途徑中斷，去勢后的動物不能較好地模擬臨床腎陽虛患者表現[31]。根據Hartley豚鼠關節軟骨快速衰老的特性，筆者通過切除雙側卵巢成功構建絕經后原發性KOA模型[32]。最近，陳穎穎等[33]對SD大鼠采用Hulth造模法加不同濃度腺嘌呤灌胃成功構建腎虛型KOA模型，并發現100 mg·kg-1是最佳濃度。

3.1.2 中醫病因學造模 腎藏精，主骨生髓，主人體發育和生殖。腎虛多由先天稟賦不足或后天失養，房勞內傷，久病耗氣，年老或受驚所致。主要分為房事傷身、老年腎陽虛、恐傷腎和先天腎虛模型[34-36]。臨床診斷腎虛的主要癥狀為異常精子質量，性功能低下，射精無力或性高潮失常[37]，而精液的代謝組學分析可用于區別腎虛不育男性的中醫“證”型[38]。然而，筆者尚未發現運用中醫病因學方法建立腎虛型KOA模型的文獻報道。

目前，腎陽虛造模法種類繁多，病理造模方法遠遠多于病因造模，而后者被越來越多的研究者青睞。但兩者都存在明顯不足，前者只能反映臨床腎虛病理的某一個方面，后者病因和病證之間不存在一一對應的關系[39]。病證結合模型將是未來發展的方向[40-42]。

3.2 血瘀模型 血瘀證的臨床表現為舌質青紫、瘀斑等，動物實驗的標準是舌質瘀紫、尾色瘀青、血流緩慢、血黏度增高等[43]，常用的造模方法是腎上腺皮質激素注射法[44]。具體方法是采用氫化可的松10 mg·kg-1·d-1肌肉注射，13次用藥后腎上腺素0.36 mg·kg-1皮下注射1次。2013年，劉振峰等[45]用此法加經典Hulth造模法成功建立了動物體征和血液流變學均符合血瘀證的KOA大鼠模型;盡管臨床上血瘀證常見，且常以活血法治之，但此后未見相關動物模型報道。

3.3 寒濕模型 《素問·痹論篇》曰：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。”風寒濕邪是重要的病因。2016年，李艷彥等[46]采用冷固法復制寒濕型KOA模型，通過將大鼠放入（6±0.5）℃的水中6 h，而后予以雙下肢石膏固定18 h，如此反復5周后建模成功。隨后，趙樂等[47]用此法成功建立寒濕證KOA動物模型，之后對此法改進，通過交替將大鼠雙下肢伸直位石膏固定和自然站立于（6±2）℃冰水中各6 h，持續6周，也能成功構建該模型[48]。2020年，孫力威[49]采用石膏固定加低溫環境刺激 加冰水站立成功建立寒濕證KOA模型。

4 KOA病證結合模型

辨病與辨證相結合已成為中醫師主流的診療模式[50]，臨床收效頗豐，雖然研究其作用機制的病證結合模型進展緩慢，卻受越來越多學者的青睞。LIU等[51]關節內注射木瓜蛋白酶，并將膝關節在50 ℃環境下作用2 h，觀察局部腫脹、疼痛和活動受限程度及軟骨病理變化，得到腎虛血瘀型KOA模型。陳穎穎等[52]通過Hulth、Hulth及D半乳糖、Hulth及腺嘌呤、Hulth及去勢法等不同造模方法對比發現，Hulth及去勢法更適合建立大鼠KOA腎陽虛證模型;而筆者前期單純采用去勢法建立豚鼠絕經后原發性KOA腎陽虛證模型，可較好地模擬絕經后原發性KOA患者臨床表現，操作雖然簡單，但耗時太長[32]。為推動KOA模型更好地服務于科研，武晏屹等[53]以KOA中、西醫最新臨床診療規范為依據，創造性地提出了動物模型與中、西醫的臨床吻合度，也更有利于病證結合模型的發展。

5 小結與展望

KOA又名骨痹、痛痹、寒痹等。《張氏醫通》曰：“骨痹者，即寒痹、痛痹也，其證痛苦攻心，四肢攣急，關節浮腫。”結合KOA中醫病因證候文獻，認為主要病因是腎虛、瘀血和寒濕，基本證型是肝腎虧虛、氣滯血瘀和寒濕阻滯證，分別對應腎陽虛、血瘀和寒濕模型。中醫學從整體辨證論治的角度出發，治療KOA有獨特的優勢，而有關KOA的中醫證候動物模型研究及相關文獻資料缺乏或零散，尤其缺少病因學模型研究;加之臨床上患者病證的復雜性和動態性，嚴重限制了中醫藥對KOA的深入研究。KOA證型大部分是多種病因相互作用的結果，進而出現多種證型兼夾或轉變;因此，實際造模時可以將多種基本模型按需求和內在規律組合，建立符合中醫臨床的復合證候模型;但干預因素過多，實際操作困難，模型穩定性和可靠性不高。另外，動物的食水、墊料、光照及周圍環境等飼養環境也極為重要。

KOA病因病機不明，是世界性難題，單純用西醫或中醫都不能有效地解除患者病痛，中西醫結合療效顯著。由此過渡到基礎實驗，將西方先進的KOA造模理念結合中醫證候模型建立病證結合動物模型將是進一步認識KOA病因病機以及藥物防治的主流方向[54]。當前KOA病證結合模型主要以西醫病理病因造模為主，缺乏中醫證候體現的病因或誘因，在西醫建模基礎上施加中醫病因可能更有益。另外，科學地評價病證結合模型很難。宋亞剛等[55]提出“證候”評價指標加“病”評價指標綜合評估，具體需要與獸醫合作采集動物的“四診信息”，結合基因組學、代謝組學和蛋白組學等信息，宏觀微觀相結合共同評價，必要時運用經典方劑佐證，這將是病證結合模型的發展方向。

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收稿日期：2021-03-20;修回日期：2021-04-15