基于多指標(biāo)測定結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的防風(fēng)飲片質(zhì)量評價(jià)

郭駿騏，張 淼，曹文正，于 澎，高紅梅

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117）

中藥飲片系指在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，根據(jù)辨證施治及調(diào)劑、制劑的需要，將中藥材加工炮制成具有一定形狀、規(guī)格的制成品[1]。作為直接原料藥，飲片的質(zhì)量至關(guān)重要[2]。多組分含量測定[3]、指紋圖譜一致性評價(jià)[4]、化學(xué)計(jì)量學(xué)[5]等多種模式被廣泛應(yīng)用于中藥原料及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量評價(jià)中。關(guān)于飲片等級劃分的依據(jù)，多以外觀性狀結(jié)合化學(xué)成分含量為主。此外，基于成分-生物活性的評價(jià)指標(biāo)也在飲片分級研究中得到應(yīng)用[6-8]。防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Szposhnikvia divaricata(Turcz.) Schischk.未抽花莖的干燥根，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙之功效[9]。目前關(guān)于藥材的等級標(biāo)準(zhǔn)只在《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》中有收載，指標(biāo)比較單一[10]。研究[11-13]依照不同的分類依據(jù)和分級方法，建立了對于防風(fēng)的不同質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本研究選取不同批次的防風(fēng)飲片為研究對象，對飲片外觀性狀及內(nèi)在質(zhì)量中的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行考察，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對防風(fēng)飲片的質(zhì)量進(jìn)行全面評價(jià)，篩選表征內(nèi)在質(zhì)量的外觀性狀指標(biāo)，采用聚類分析對所選飲片進(jìn)行等級劃分，以期為防風(fēng)飲片的質(zhì)量和等級研究提供合理依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 儀器：LC-2030型高相液相色譜儀，日本島津公司；Hypersil ODS2 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），大連依利特分析儀器有限公司；FA1204B型萬分之一電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；AB135-S型十萬分之一分析天平，瑞士梅特勒－托利多公司；3NH-TS6010 臺式分光測色儀，深圳市三恩時(shí)科技有限公司；標(biāo)康SL01-22 數(shù)顯游標(biāo)卡尺（杭州標(biāo)康科技有限公司）。試劑：升麻素苷對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號Y24S6H3805，純度98%；5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號P05M8F35478，純度98%。甲醇為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號 185366；乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號 186341；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.2 樣品 本研究收集的30 批防風(fēng)飲片，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)蔡廣知副教授鑒定均為傘形科植物防風(fēng)Szposhnikvia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根的炮制加工品。其中，來自安國市一方藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于河北的藥材批號是18120203、CP17051901、18110606；安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是1805006、1803001、1809002；安國市譽(yù)林藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于吉林的藥材批號是180301、180902、180503；安國祁安藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于河北的藥材批號是180403、181102、181201；安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司的產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是03-19010101、180101、02-19010101；河北仁心藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是13017024、13018003、13017029；安國市同義中藥飲片有限公司的產(chǎn)于河北的藥材批號是18040047、19010002、18110154；河北安國振宇藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于河北的藥材批號是190101、171201、181202；河北祁新中藥顆粒飲片有限公司的產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是20170902、20181201、20180501；安國市祁澳中藥飲片有限公司產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是1711541111、1803541113、1805541132。共30 批，編號是1-30。

2 方法及結(jié)果

2.1 防風(fēng)飲片外觀性狀參數(shù)測定

2.1.1 形態(tài)學(xué)測定 防風(fēng)飲片為圓形或橢圓形的厚片，每批樣品隨機(jī)選取3組，每組100個(gè)飲片作為測量對象，以飲片外周最寬處兩端的距離作為直徑，測量并記錄，并計(jì)算每批樣品的平均直徑。結(jié)果見表1。

2.1.2 顏色測定 1）測色模式，反射光；2）測色空間，采用L*、a*、b*色空間，其中L*代表亮度，a*代表紅-綠色，b*代表藍(lán)-黃色，E*ab 代表總色差，公式為E*ab=（L*2+a*2+b*2）1/2；3）測定徑，4 mm；4）觀察視野，10°；5）觀察光源，D65 光（代表自然日光，色溫度6504 k），光源為CIE（國際照明委員會）認(rèn)可。取防風(fēng)飲片細(xì)粉適量，在D65 光、A 光（代表白熾燈光，2856 k）光源下分別測定顏色，其他參數(shù)設(shè)定同上，每份樣品平行測定3 次，取平均值。結(jié)果見表1。

表1 防風(fēng)飲片外觀性狀測定結(jié)果

2.2 浸出物測定 照醇溶性浸出物測定法《中國藥典》2020 版四部通則2201 項(xiàng)下的熱浸法測定[15]，用乙醇作溶劑。結(jié)果見表2。

2.3 指標(biāo)性成分含量測定 按《中國藥典》2020 版一部防風(fēng)項(xiàng)下含量測定方法進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表2，對照品及供試品圖譜見圖1。

表2 浸出物及指標(biāo)性成分含量測定結(jié)果 %

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）HPLC 圖

2.4 相關(guān)性分析 采用SPSS 22.0 軟件對防風(fēng)飲片直徑、顏色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果見表3。

表3 相關(guān)性分析結(jié)果

2.5 主成分分析（PCA）以防風(fēng)飲片的直徑、顏色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為變量，進(jìn)行主成分分析。計(jì)算特征值及方差貢獻(xiàn)率，以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，提取到2 個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到80.765%，可以代表樣品的大部分信息，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的樣品之間有較大差異。詳細(xì)結(jié)果見表4、表5。

表4 主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率 %

表5 主成分分析因子載荷矩陣

圖2 防風(fēng)飲片PCA 得分圖

2.6 正交偏最小二乘法判別分析（OLPS-DA）以防風(fēng)飲片的直徑、顏色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析。在構(gòu)建的OLPS-DA 模型中，累計(jì)解釋能力參數(shù)RX2cum 和RY2cum 分別為0.724 和0.878，預(yù)測能力參數(shù)Q2cum 為0.785，表明模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力較好，可用于樣品差異的分析。由OLPS-DA得分圖可知，與主成分分析結(jié)果相似，30 批樣品能夠被明顯地區(qū)分開，見圖3。繪制變量重要性投影圖（variable importance in projection，VIP），以VIP 值>1為度，篩選關(guān)鍵變量。在所測定的所有指標(biāo)中，浸出物（VIP=1.80）、L*（VIP=1.62）及E*ab（VIP=1.45）均大于1，可以認(rèn)為在2 組樣品差異產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。見圖4。

圖3 防風(fēng)飲片OLPS-DA 得分圖

圖4 防風(fēng)飲片各指標(biāo)的VIP 值

2.7 防風(fēng)飲片等級劃分 初步選擇直徑、L*及E*ab3個(gè)指標(biāo)參與防風(fēng)飲片的等級劃分，采用SPSS 22.0 軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐式平方距離為測度，對30批樣品進(jìn)行進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析和K-均值聚類分析。由圖5 可知，當(dāng)聚類距離為15 時(shí)，所有樣品被分為2 類，與PCA 分析及OLPS-DA 分析結(jié)果相似。其中FF-4～FF-6、FF-16～FF-18、FF-25～FF-30 等12 個(gè)樣品被聚為一類，其余18 個(gè)樣品被聚為另一類。見圖5。根據(jù)K-均值聚類分析結(jié)果，可初步將30 批防風(fēng)飲片劃分為2 個(gè)等級。其中，一等防風(fēng)飲片：直徑≤8.4cm，L*≤45.49，E*ab ≤60.27。二等防風(fēng)飲片：直徑為8.4～10.6 cm，L*為45.49～54.19，E*ab 為60.27～67.03，見表6。按照最低定級原則，在所研究的30 批防風(fēng)飲片中，無一等品；二等品有14 批（FF-4～FF-6，F(xiàn)F-9，F(xiàn)F-16～FF-9、FF-25～FF-30），其中僅FF-9 的藥材產(chǎn)地為吉林，F(xiàn)F-9 的藥材產(chǎn)地為河北，其余二等防風(fēng)飲片的藥材產(chǎn)地均為內(nèi)蒙古。剩余的16批飲片均為統(tǒng)貨。分級結(jié)果經(jīng)過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，所劃分等級樣品質(zhì)量有顯著性差異（P＜0.01），表明分級依據(jù)合理、可靠。

圖5 防風(fēng)飲片聚類分析圖

表6 防風(fēng)飲片最終聚類中心

3 討論

本研究結(jié)果表明，防風(fēng)飲片的直徑與其內(nèi)在含量有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)中4 種色原酮含量與根的直徑呈明顯的負(fù)相關(guān)[14]。本研究旨在尋找防風(fēng)飲片中能夠表征內(nèi)在質(zhì)量的外觀性狀，將其作為指標(biāo)參與等級劃分。結(jié)果表明，直徑以及顏色中的L*、E*ab 與內(nèi)在質(zhì)量相關(guān)性較大，可作為防風(fēng)飲片分級研究的重要參考依據(jù)。

本研究對不同批次防風(fēng)飲片的外觀性狀指標(biāo)和內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行檢測，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對所測內(nèi)、外指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)果表明飲片間的差異主要是因?yàn)轱嬈瑏碓此幉牡漠a(chǎn)地不同。因此，對不同批次防風(fēng)飲片的分析，揭示了飲片質(zhì)量與其來源藥材的產(chǎn)地具有一定的相關(guān)性，可為防風(fēng)飲片質(zhì)量評價(jià)以及防風(fēng)藥材種植基地選擇提供依據(jù)。