MIF基因敲除小鼠各臟器中的炎癥因子的表達(dá)

郗穎，雷如意，朱志強(qiáng)

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.EICU，河南 鄭州 450000）

近年來的研究表明，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的過度表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如MIF出現(xiàn)在內(nèi)毒素血癥的急性期，加速膿毒癥患者死亡進(jìn)程[1]。MIF與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊形成及冠心病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，加重小鼠的心肌肥厚[2]，拮抗MIF 可以減低前列腺炎的炎癥水平[3]。MIF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用復(fù)雜，在缺血性腦卒中、脊髓損傷以及神經(jīng)退行性病變中發(fā)揮著損傷以及保護(hù)的雙重作用[4]。MIF在激素抵抗型支氣管哮喘表達(dá)顯著升高，可能與參與激素抵抗有關(guān)[5]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血中的MIF水平顯著增高，與狼瘡的疾病活躍程度呈現(xiàn)正相關(guān)，與血補(bǔ)體C3水平降低以及24h 尿蛋白定量相關(guān)[6]。胰腺導(dǎo)管腺癌病人的外泌體中MIF水平顯著增加，阻斷MIF 可以有效抑制腫瘤的肝轉(zhuǎn)移[7]。由此可見MIF在全身多個(gè)系統(tǒng)的疾病中發(fā)揮著重要的作用，探討MIF在各個(gè)臟器病變過程扮演怎樣的角色對(duì)于相關(guān)疾病的診治具有重要意義。本文擬構(gòu)建MIF基因敲除小鼠，研究MIF在全身多個(gè)臟器中蛋白表達(dá)水平，為臟器病變相關(guān)的疾病研究提供參考。

1 材料方法

1.1 試劑與儀器 TRIzol、PrimeScript RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Takara 公司；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) (美國Sigma 公司)；酶聯(lián)免疫分析試劑盒(德國Millipore 公司)；酶標(biāo)儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)；基因擴(kuò)增儀(美國BIO-RAD 公司)。

1.2 研究動(dòng)物及分組 MIF 敲除的實(shí)驗(yàn)小鼠(C57BL/6 背景)購于南京生物研究。無病原菌環(huán)境下飼養(yǎng)，12h/12h 晝夜交替，恒溫22℃，自由攝食飲水。由一對(duì)MIF 雜合體小鼠繁殖后代，子代中有MIF-/-(KO) 小鼠，雜合小鼠和野生型(wild type,WT)小鼠，取其中的雜合體小鼠進(jìn)行配對(duì)后，再次繁殖，直至KO 小鼠及WT 小鼠到達(dá)需要的種群數(shù)。將8 周齡雄性WT及KO 組小鼠腹腔注射200μl 含25μg LPS 分別作為LPS組及KO+LPS組，KO 組及WT 組小鼠腹腔注射200μl的生理鹽水溶液，24h 后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，每組小鼠5 只。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的許可。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 MIF mRNA 鑒定 剪取各組小鼠的鼠尾，勻漿。總RNA 用TRIzol 進(jìn)行提取，取2μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，按擴(kuò)增試劑盒說明操作，使用實(shí)時(shí)定量PCR 進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增條件：總反應(yīng)體系25μl，95℃預(yù)變性10s，95℃5s，65℃20s，78℃10s，共40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-△△ct法則得到基因的相對(duì)表達(dá)量。MIF基因的上游引物是：5’-GTTTCTGTCGGAGCTCAC-3’，下游引物是：5’-AGCGAAGGTGGAACCGTTCCA-3’，以MIF -actin 為內(nèi)參，上游引物是：5’-GTCGTCGACAACCGCTCCGGCA-3’，下游引物 是：5’-CTGGGCCTCGTCGCCCACATAG-3’。

1.3.2 體質(zhì)量檢測(cè) 記錄并比較各組小鼠的體質(zhì)量。

1.3.3 血清MIF 檢測(cè) 腹腔注射24h 后，摘除眼球取血，用ELISA 試劑盒測(cè)量各組小鼠血清中的MIF水平。

1.3.4 各個(gè)組織的MIF、表達(dá) 將所有組別小鼠安樂處死，取肝臟、腎臟、脾臟、肺臟，每g 組織加入3ml 生理鹽水，組織進(jìn)行勻漿，使用ELISA 試劑盒檢上述臟器MIF水平。

1.3.5 細(xì)胞因子檢測(cè) 組織或血清中的MIF，白介素-1β (interleukin-1,IL-1)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平通過ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)。ELISA 試劑盒購自RD 公司。具體操作步驟按照ELISA 試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用IBM SPSS 20.0.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)(n)或率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的尾MIFmRNA及體質(zhì)量比較 各組小鼠鼠尾MIFmRNA 差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，與WT 組比，KO 組MIFmRNA 顯著降低(P＜0.05)，LPS 組和KO+LPS 組的MIFmRNA 明顯增高(P＜0.05)，與KO 組比，KO+LPS 組MIFmRNA 明顯降低(P＜0.05)，與LPS 組比，KO+LPS 組MIFmRNA顯著較低(P＜0.05)，各組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1和圖1。

表1 各組小鼠的尾MIFmRNA及體質(zhì)量比較

圖1 各組小鼠的尾MIFmRNA 比較

2.2 各組小鼠血液、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟MIF表達(dá)比較 各組小鼠血液、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟MIF表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，與WT組比，KO 組MIF 顯著降低(P＜0.05)，LPS 組和KO+LPS 組的MIF 明顯增高(P＜0.05)，與KO 組比，KO+LPS 組MIF 明顯降低(P＜0.05)，與LPS 組比，KO+LPS 組MIF 顯著較低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血液、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟MIF表達(dá)比較(n=5,g/ml)

2.3 各組小鼠血液、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟IL-1β及TNF-表達(dá)比較 各組小鼠血液、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟IL-1β及TNF-表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，與WT 組比，KO 組血液、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟IL-1β及TNF-顯著降低(P＜0.05)，LPS組和KO+LPS 組的IL-1β及TNF-明顯降低(P＜0.05)，與KO 組比，KO+LPS 組IL-1β及TNF-明顯降低(P＜0.05)，與LPS 組比，KO+LPS 組IL-1β及TNF-顯著較低(P＜0.05)。見表3和表4。

表3 各組小鼠血液、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟IL-1β表達(dá)比較(n=5,pg/ml)

表4 各組小鼠血液、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟TNF-表達(dá)比較(n=5,pg/ml)

3 討論

MIF 是一種保守的分子，其基因全長348bp，分子量約為12.5kD，是一種三聚體結(jié)構(gòu)。每個(gè)單體由2 個(gè)反向的α 螺旋包裹住4 次折疊的β 折疊結(jié)構(gòu)[8]，由巨噬細(xì)胞、垂體前葉細(xì)胞及T細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌[9,10]。MIF 是一種重要的促炎因子，其可以拮抗類固醇激素的抑制炎癥反應(yīng)的作用，在全身及局部炎癥中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)單核巨噬細(xì)胞受到糖皮質(zhì)激素刺激時(shí)可以分泌MIF[11,12]，MIF在有絲分裂或抗原刺激誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化中起重要的調(diào)節(jié)作用，活化的T細(xì)胞產(chǎn)生MIF和中和的抗MIF 抗體在體外抑制T細(xì)胞增殖和白細(xì)胞介素2(interleukin 2,IL-2)的產(chǎn)生，在體內(nèi)抑制抗原驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞活化和抗體的產(chǎn)生[13,14]。T細(xì)胞在糖皮質(zhì)激素刺激下也會(huì)釋放MIF，抑制糖皮質(zhì)激素對(duì)T細(xì)胞增殖、IL-2和干擾素γ(interferon gamma,INF-γ)產(chǎn)生的抑制[15,16]。在炎癥應(yīng)答過程中，MIF 可顯著抑制巨噬細(xì)胞的聚集、增生和黏附、吞噬作用，促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放，拮抗類固醇激素的抑制炎癥的作用[3]，在全身和局部炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

MIF基因敲除小鼠是一種廣泛使用的研究MIF 功能的模式動(dòng)物?；A(chǔ)狀態(tài)下，各主要臟器的MIF表達(dá)對(duì)研究MIF在不同組織器官中的作用尤為重要。本研究構(gòu)建MIF基因敲除小鼠，檢測(cè)鼠尾、血清及主要臟器中的MIFmRNA 或MIF表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與WT 小鼠比，MIF基因敲除小鼠的鼠尾MIFmRNA、血清中的MIF表達(dá)較少，在炎癥刺激下，與WT 小鼠或MIF基因敲除小鼠相比，LPS 刺激后小鼠的鼠尾MIFmRNA、血清中的MIF表達(dá)均明顯增高，其中WT 小鼠受LPS 刺激的MIFmRNA及MIF表達(dá)最高，類似的結(jié)果在肝臟、脾臟及肺臟等主要臟器中得到佐證，可見MIF 參與了炎癥的調(diào)節(jié)過程。進(jìn)一步，與WT 小鼠比，MIF基因敲除小鼠血清、肝臟、脾臟及肺臟等主要臟器的IL-1β及TNF-炎癥因子相對(duì)較低，但給予LPS刺激后，小鼠血清及主要臟器的炎癥因子均明顯增高，WT 小鼠增高顯著，MIF基因敲除小鼠有增高，但不及WT 小鼠，提示MIF在收到外界刺激因素時(shí)作為一種應(yīng)激的細(xì)胞因子由相應(yīng)的細(xì)胞產(chǎn)生并釋放，從而發(fā)揮其相應(yīng)的生理功能，但給予MIF敲除處理時(shí)，炎癥反應(yīng)則受到抑制，該結(jié)果也一定程度驗(yàn)證了MIF基因敲除處理胰腺導(dǎo)管癌小鼠后可顯著提高存活率[17]，MIF 信號(hào)通路作用于炎癥系統(tǒng)，提高對(duì)內(nèi)毒素及細(xì)菌的忍受能力，降低胰腺導(dǎo)管癌轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究也顯示，各個(gè)臟器中的MIF及炎癥因子表達(dá)水平不同，與肝臟及肺臟相比，脾臟的MIF及炎癥因子表達(dá)相對(duì)較高，可能原因在于，脾臟具有重要的免疫調(diào)節(jié)的作用，脾臟產(chǎn)生單核巨噬細(xì)胞相對(duì)較多，而單核巨噬細(xì)胞可分泌MIF。

綜上所述，本研究為后續(xù)研究特異臟器中MIF的作用提供了重要的參考，為MIF 相關(guān)的動(dòng)物模型提供了依據(jù)，具有重要的價(jià)值。