miRNA-223-3p在冠心病合并心肌纖維化中的變化及臨床意義

王東華

（鶴壁煤業（集團）有限公司總醫院心內科，河南 鶴壁 458000）

冠心病是一種發病率和死亡率均較高的疾病，嚴重威脅人類健康，目前公認動脈粥樣硬化的病理過程是導致冠心病發生、演化以及進一步惡化的主要原因[1]。冠心病疾病進展過程中，心臟成纖維細胞被激活合成過多的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，細胞外基質（ECM）過度沉積于心肌組織中，心肌纖維化的發生導致心肌僵硬、心律失常、心功能降低，是心臟重構的重要病理學基礎，其最終結局是心功能衰竭[2,3]。抑制ECM 過度沉積是預防心肌纖維化的重要措施,臨床也需要尋找新的生物標志物為心肌纖維化提供準確、敏感的預警,為冠心病的治療和預后判斷提供依據[4]。微小核糖核酸（mi RNA）是一類序列高度保守的內源性單鏈非編碼小分子RNA，既往研究發現miRNA 參與冠心病發生、發展病理過程的調節，對心肌纖維化有一定的調控作用[5]。本研究選擇對冠心病患者的血清miR NA-223-3p 進行檢測，旨在探討其與心肌纖維化的關聯，報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2017年1 月-2019年12 月我院收治的冠心病患者102例，其中男61例，女41例，年齡42～76 歲，平均57.45±11.39 歲。診斷標準：經冠脈造影證實存在1 支或1 支以上的冠狀動脈血管直徑狹窄≧50%。排除標準：合并先天性心臟病、心臟瓣膜病、心律失常或慢性阻塞性肺疾病者；合并嚴重肝腎功能不全者；合并急慢性感染性疾病者；合并血液系統疾病、周圍血管性疾病者；合并惡性腫瘤或全身免疫系統疾病者。根據心臟磁共振成像的診斷結果進行分組，冠心病合并心肌纖維化者53例為觀察組，未合并心肌纖維化者49例為對照組。本研究經醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集 記錄性別、年齡、體重指數、飲酒史、吸煙史、糖尿病史、高血壓病史、冠心病家族史等情況。入院次日清晨采集患者空腹外周靜脈血6ml，離心并分離血清，分三份備用。一份用于各項生化指標的檢測，一份用于血清miRNA-223-3p 檢測，另外一份用于纖維化指標檢測。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測C 反應蛋白（CRP）水平，試劑盒由上海康朗生物科技有限公司提供；采用邁瑞BS-180 全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平；采用血糖儀檢查空腹血糖水平。

1.2.2 血清miRNA-223-3p 檢測 血清RNA 快速提取試劑盒購買自杭州昊鑫生物科技股份有限公司，提取步驟如下：⑴向250μl 血清中加入750μl Lysis buffer 裂解試劑,室溫孵育15min；⑵加入200μl 氯仿，劇烈振蕩15s，室溫孵育2min；⑶4°C 12000rpm 條件下離心10min，可見樣品分三層，RNA 存在于上層無色水相；⑷小心吸取上清液，轉移至新的EP 管中，加入1.5 倍體積的常溫狀態下的無水乙醇，混勻，轉移至帶吸附柱的2ml 離心管中，4°C 12000rpm 條件下離心30s，棄液；⑸加入700μl Wash Solution 1，離心，棄液，再加入500μl Wash Solution 2，離心，棄液，重復一遍；⑹將吸附柱放回空離心管中，4°C 12000rpm 條件下離心2min，將吸附柱放到一個新的無RNase 離心管中，加入預熱的無RNase水40μl，室溫靜置1min，4°C 12000rpm 條件下離心1min，得到總RNA。使用一步法miRNA 反轉錄試劑盒（新海基因）進行反轉錄，合成cDNA。實時熒光定量PCR：根據SYBR Premix Ex Taq TM II（Taka Ra，日本）制備20μl RT-qPCR 反應體系，并使用ABI7500 熒光定量PCR 儀器（Applied Biosystems，USA）進行擴增。計算目的基因miRNA-223-3p的表達水平。

1.2.3 血清纖維化指標檢測 采用雙抗體酶聯免疫吸附法測定Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）水平，試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司提供。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件對數據進行處理和分析。計數數據以（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；符合正態分布的計量數據以（）表示，兩組間比較采取獨立樣本t 檢驗；用受試者工作曲線（ROC）和曲線下面積（AUC）評估血清miRNA-223-3p對心肌纖維化的診斷價值；危險因素分析采取多因素Logistic 回歸模型；相關性分析采取Pearson 相關分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組冠心病患者基線資料比較 兩組患者性別、年齡、體重指數、飲酒史、吸煙史、糖尿病史、高血壓病史、冠心病家族史、TG、TC、HDL-C、LDL-C、空腹血糖比較，差異無統計學意義（P>0.05），觀察組患者CRP水平高于對照組（P<0.05）。見表1。

表1 兩組冠心病患者基線資料比較[n（%），]

表1 兩組冠心病患者基線資料比較[n（%），]

2.2 冠心病患者血清miRNA-223-3p對心肌纖維化的診斷價值 觀察組、對照組患者血清miRNA-223-3p表達水平分別為6.04±1.10、3.69±0.81，觀察組水平明顯高于對照組（t=12.376，P<0.05）。ROC曲線分析結果顯示，血清miRNA-223-3p 診斷心肌纖維化的AUC 值為0.961（95%CI：0.903～0.989，P<0.05），臨界值取4.61 時診斷價值最高，敏感度為92.45%，特異度為87.76%，約登指數為0.8021。見圖1。

圖1 血清miRNA-223-3p 診斷心肌纖維化的ROC 曲線

2.3 冠心病患者發生心肌纖維化的危險因素分析以冠心病患者是否發生心肌纖維化為因變量（賦值：心肌纖維化=1，無心肌纖維化=0），將血清CRP、miRNA-223-3p 作為自變量進行多因素Logistic 回歸分析，結果顯示，CRP﹥7.53mg/L、miRNA-223-3p﹥4.61 是冠心病患者發生心肌纖維化的獨立危險因素（P<0.05）。見表2。

表2 冠心病患者發生心肌纖維化的危險因素分析

2.4 兩組患者血清纖維化指標比較 觀察組患者血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9水平高于對照組（P<0.05）。見表3。

表3 兩組患者血清纖維化指標比較（）

表3 兩組患者血清纖維化指標比較（）

2.5 相關性分析 Pearson 相關分析結果顯示，102例冠心病患者血清miRNA-223-3p水平與血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9水平均呈現顯著的正相關（r=0.567、0.492、0.687，P<0.05）。

3 討論

心肌纖維化過程是心臟重構的重要病理學基礎，而心臟重構是導致心力衰竭發生的基本機制，因此心肌纖維化的早期診斷和有效防治尤為重要[6]。除心臟影像學檢查外，血清生物標志物檢測是臨床上判斷心肌纖維化的有效手段。

miRNA與心血管疾病的關系密切，在心肌梗死、動脈粥樣硬化、心律失常等疾病的病理機制和發展演變過程中扮演了重要角色[7]。近年來研究發現，多種miRNA通過不同信號通路參與了心肌纖維化的調控[8]。miRNA-223 位于X 染色體的q12基因組內，在生物進化過程中具有高度的保守性，在調控細胞增值分化、抑制炎癥反應過程中扮演著重要角色[9]。miRNA-223 是冠心病的保護因素，通過多種靶基因保護機體維持正常的生理過程，在疾病進展過程中出現代償性增高[10]。本研究選擇對102例冠心病患者的血清miRNA-223-3p水平進行檢測，結果顯示，合并心肌纖維化者血清miRNA-223-3p水平明顯高于無心肌纖維化者。經ROC 曲線分析發現血清miRNA-223-3p 診斷心肌纖維化的AUC 值為0.961，臨界值取4.61 時診斷價值最高，敏感度為92.45%，特異度為87.76%，提示miRNA-223-3p 可作為心肌纖維化的血清學生物標志物。進一步進行多因素Logistic 回歸分析，結果顯示，miRNA-223-3p﹥4.61 是冠心病患者發生心肌纖維化的獨立危險因素。上述結果表明，miRNA-223-3p與心肌纖維化存在顯著的相關性，臨床上可通過該項指標的檢測判斷冠心病是否發生心肌纖維化。

本研究還對冠心病患者的血清CRP水平進行檢測，評估其炎癥水平，發現合并心肌纖維化患者炎癥水平明顯高于無心肌纖維化者，且CRP﹥7.53mg/L 是冠心病患者發生心肌纖維化的獨立危險因素。上述結果提示冠心病患者的炎癥反應也會影響到心肌纖維化的發生，而miRNA-223-3p對炎癥反應有抑制作用，因此冠心病患者炎癥水平越高其在血清中代償性增高，發生心肌纖維化的可能性越大。部分研究發現[11,12]，miRNA-223與冠心病的危險因素（血脂異常、吸煙、糖尿病）存在一定的關聯性，但本研究結果顯示，兩組患者在吸煙史、糖尿病史、血脂水平等方面比較，差異不顯著，分析原因可能與病例選擇偏倚有關，今后可擴大病例入選范圍和樣本量進一步展開研究。

Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原是較為常見的血清纖維化指標，Ⅰ型膠原增生可導致心肌僵硬度增加，Ⅲ型膠原伸展回彈性較大，過度增生導致膠原纖維強度降低，心肌組織往往不能承受較大的血液動力學壓力，因此易發生梗死區的變薄和延伸，需早期干預Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的過度增生[13,14]。MMP-9 作為一種鋅依賴的金屬蛋白內切酶家族中的一員，參與降解多種ECM 成分，調節MMP-9的表達可對抗心肌纖維化的發生[15]。因此本研究選擇上述血清纖維化指標進行檢測，發現合并心肌纖維化者血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9水平明顯更高，而Pearson 相關分析結果顯示，102例冠心病患者血清miRNA-223-3p水平與各項血清纖維化指標均呈現顯著的正相關。此結果再次驗證了miRNA-223-3p與心肌纖維化的相關性，冠心病患者心肌纖維化程度越嚴重則其在血清中表達越高，可作為反映心肌纖維化程度的指標在臨床應用。

綜上所述，冠心病患者血清miRNA-223-3p水平對心肌纖維化有較高的診斷價值，可反映心肌纖維化程度，該指標聯合血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9水平變化可作為心肌纖維化的生物標志物用于評估病情嚴重程度，但miRNA-223-3p參與調控心肌纖維化的機制尚需進一步的研究。