ADP核糖基化因子樣6相互作用蛋白1（ARL6lP1）低表達對電離輻射所致小鼠小腸上皮細胞損傷的影響

閆 華，邢 源，葉雨萌，郝延輝，喻 超，賈兆乾，左紅艷，李 楊

（1.軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所，北京 100850；2.解放軍總醫院第六醫學中心，北京 100048；3.河北北方學院藥學系，河北省神經藥理學重點實驗室，河北 張家口 075000）

小腸是人體內對電離輻射最敏感的器官之一［1-2］。電離輻射可通過破壞小腸上皮黏膜的隱窩-絨毛結構，影響小腸上皮黏膜的吸收及屏障功能，引發放射性腸損傷（radiation induced intestinal injury，RⅢ）［3-5］。RⅢ的發生發展是全身放射性損傷死亡和救治失敗的關鍵原因，腸損傷及其導致的水電解質紊亂、酸堿失衡和嚴重的腸源性感染等均為急性放射性損傷的主要死亡原因［3，6-8］。腹部和骨盆腫瘤患者接受局部放射治療后，通常會引發RⅢ，＞15%的患者會形成慢性腸損傷，這不僅明顯影響患者的生活質量，同時限制腫瘤放療的劑量，一定程度上影響腫瘤的治療效果［3，9-10］。但目前其損傷機制尚未闡明，缺少有效的診斷及防治措施。因此，亟需進一步探究其發病機制，尋找更為有效的RⅢ敏感生物標志物和防治靶點。

ADP核糖基化因子樣6相互作用蛋白1（ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein 1，ARL6IP1）位于內質網內膜，對于維持內質網的結構和功能至關重要［11-13］。研究發現，Arl6ip1基因與腫瘤細胞耐藥性相關，具有抗凋亡特性，參與腫瘤細胞的生長和侵襲等過程［14］。Arl6ip1基因還參與興奮性突觸中的主要興奮性神經遞質谷氨酸的調節，沉默其表達可引發功能障礙［15］。有報道認為，遺傳性痙攣性截癱和多發性感覺運動神經疾病等患者體內存在Arl6ip1基因突變體［16-17］。

本課題組前期制備了小鼠RⅢ模型，通過單細胞轉錄組測序技術研究細胞放射敏感性并篩選與放射敏感性相關基因，發現腸道主要類型細胞如小腸干細胞、上皮細胞、巨噬細胞和T細胞等不同亞群細胞輻射敏感性存在較大差異。通過對照射后腸道主要細胞類型的存活細胞基因表達特征進行分析，顯示Arl6ip1基因表達出現特異性增高。為驗證Arl6ip1基因在放射性損傷中的作用，本研究首先觀察放射性腸損傷模型小鼠空腸組織ARL6IP1蛋白表達的變化；隨后設計小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），構建Arl6ip1敲低的小腸上皮細胞IEC-6，觀察ARL6IP1低表達對放射致DNA損傷和細胞存活率的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、主要試劑和儀器

50只雄性SPF級C57BL/6N小鼠，體重20～25 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2016-0001，動物飼養在軍事醫學研究院動物房（溫度21～23℃，濕度40%～60%）。IEC-6細胞，廣州吉妮歐生物科技公司。為防止脫靶，根據Arl6ip1基因序列，設計3條序列不同的siRNA（表1）作用于Arl6ip1基因mRNA的不同位點，并合成雙鏈陰性對照siRNA（negative control siRNA，siRNA-NC），siRNA序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，分別插入慢病毒載體LV5（EF-1aF/GFP&Puro）中。小鼠抗人磷酸化組蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX，γH2AX）單抗、兔抗小鼠GAPDH單抗和兔抗人ARL6IP1單抗（一抗）及Alexa Fluor 647標記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗），美國Abcam公司；辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG抗體（二抗），中山金橋公司；胎牛血清和DMEM液體培養基，美國Gibco公司；青霉素和鏈霉素溶液，美國HyClone公司；0.25% EDTA-胰蛋白酶，美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶公司；CCK-8試劑盒，美國Bimake公司。

Tab.1 Small interfering RNA（siRNA）sequences targeting ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein 1（Arl6ip1）

60Co源，軍事醫學研究院；37℃細胞培養箱，美國Thermo公司；超凈工作臺，南通滬南科學儀器公司；蛋白電泳儀，北京六一儀器廠；臺式高速離心機，上海醫學分析儀器廠；FACS Calibur流式細胞儀，美國BD公司；多功能酶標儀（Victor-X3）和PE Time-lapse轉盤共聚焦活細胞成像系統，美國PerkinElmer公司。

1.2 小鼠急性RⅢ模型的制備

將C57BL/6N小鼠隨機分為正常對照組（10只）和照射組（40只），照射組采用60Co源γ射線進行照射。小鼠稱重后ip給予0.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉。麻醉后固定于自制木板上，暴露腹部（上至劍突，下至恥骨聯合），用鉛磚將其余部位屏蔽，進行全腹部單次照射：靶距為3 m，劑量15 Gy，劑量率123.69 cGy·min-1；正常對照組進行假照射（將小鼠進行麻醉固定，但未照射）。照射后，每天觀察小鼠的飲食、精神及活動狀態及有無腹瀉和血便等，記錄體重和存活數。

1.3 Western印跡法檢測小鼠空腸組織ARL6lP1蛋白表達

分別于照射后1，3，7和14 d取5只小鼠處死，從腹腔中取出整段小腸，去除內容物后用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后稱量。從小鼠幽門開始截去5 cm，之后取空腸10 cm稱重，剪碎后按1∶10（體積比）加入RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑），并用超聲儀將組織震碎，離心后取上清液。加入等體積上樣緩沖液，置沸水浴中變性10 min。用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度，取適量變性蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。蛋白分離結束后，采用轉膜儀轉膜，將帶有蛋白樣品的聚偏氟乙烯（PVDF）膜浸入封閉液（5%脫脂奶粉）處理1～2 h。用封閉液洗膜后加入特異性一抗（1∶1000）4℃孵育24 h。再以封閉液洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗（1∶10000）于37℃反應1 h。以二氨聯苯胺顯影后凝膠成像系統拍照，以GAPDH作內參，分析蛋白條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA）值。ARL6IP1蛋白相對表達水平以IAARL6IP1/IAGAPDH比值表示。

1.4 慢病毒轉染細胞及Arl6ip1敲低作用的驗證

將IEC-6細胞從液氮中取出后迅速置37℃水浴中解凍，并用移液器將細胞懸液轉移入離心管中。離心洗凈凍存液后，采用DMEM培養基（含10%胎牛血清）于37℃，5% CO2培養箱培養。將IEC-6細胞（1×105L-1）以每孔500 μL接種于24孔板中，待細胞密度達約70%，棄培養基，將siRNA-NC，Arl6ip1-siRNA-132，Arl6ip1-siRNA-249和 Arl6ip1-siRNA-565慢病毒30 μL 加入270 μL培養基中，充分混勻后加入相應孔中，每組6復孔。將24孔板置37℃，5% CO2細胞培養箱中轉染24 h。棄含有siRNA慢病毒的培養基，加入500 μL培養基繼續培養。慢病毒轉染后72 h，棄培養基，加入胰酶消化細胞，用PBS溶液洗滌后重懸細胞，用流式細胞術檢測細胞中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達。GFP陽性細胞為成功轉染病毒的細胞。轉染效率（%）=GFP陽性細胞數/總細胞數×100%。

慢病毒轉染后72 h，棄培養基，用生理鹽水洗滌1次，每孔加入100 μL RIPA細胞裂解液，用細胞刮將貼壁細胞刮下，轉移至離心管中，置于冰上裂解15 min。離心后取上清液，用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度，用Western印跡法驗證siRNA-NC和3條Arl6ip1-siRNA特異性敲低ARL6IP1效果。

1.5 細胞和照射

將IEC-6細胞隨機分為4組：即細胞對照組、細胞照射組、siRNA-NC轉染照射組和Arl6ip1-siRNA-565轉染照射組，每組6復孔，每孔加IEC-6 500 μL（1×105L-1）。Arl6ip1-siRNA-565和siRNA-NC慢病毒轉染IEC-6細胞后72 h，將細胞照射組、siRNA-NC轉染照射組和Arl6ip1-siRNA-565轉染照射組置60Co源照射臺進行γ射線照射：靶距為4 m，劑量15 Gy，劑量率68.34 cGy·min-1。細胞對照組進行假照射（將細胞24孔板帶至照射室，但未照射）。

1.6 CCK-8法檢測細胞存活率

在照射后24和48 h，各組每孔加入10 μL CCK-8工作液，置細胞培養箱孵育2 h，用多功能酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度值（A450nm）。細胞存活率（%）=〔實驗孔A450nm-空白孔A450nm〕/〔細胞對照孔A450nm-空白孔A450nm〕×100%。空白孔含培養基和CCK-8溶液，無細胞。

1.7 免疫熒光法檢測細胞中 γH2AX表達水平

將IEC-6細胞（1×105L-1）500 μL接種于玻片上，同1.6照射后3 h，各組加入適量4%多聚甲醛進行細胞固定。室溫孵育15 min后撈片，用PBS洗滌2次。將0.3% Triton X-100滴加玻片上，室溫孵育10 min，PBS洗滌2次；以PBS稀釋小鼠抗人γH2AX單抗（一抗，1∶200）滴加于玻片上，4℃孵育過夜，用PBS洗滌2次；滴加Alexa Fluor 647標記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗，1∶2000），37℃避光孵育1 h，用封片劑（含DAPI）封片，并在熒光顯微鏡下觀察。紅色熒光表示γH2AX表達陽性，熒光強度表示γH2AX的表達水平。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 小鼠照射后一般狀態和存活數

小鼠腹部照射后1 d，體重和狀態較照射前無明顯變化；照射后2 d，開始出現進食不佳，輕微腹瀉，體重減輕；照射后3 d，小鼠出現精神萎靡、懶動、蜷縮成團，皮毛黯淡無光且脫毛，嚴重腹瀉，甚至個別小鼠出現血便，體重減輕；照射后7 d，小鼠活動緩慢，持續腹瀉，體重持續減輕；照射后14 d，小鼠狀態恢復良好，皮毛光滑，體重逐步恢復。

照射組小鼠自照射后2 d開始出現死亡，死亡1只；照射后3～5 d為死亡高峰期，死亡7只；照射后14 d，共死亡8只，死亡率為20%。正常對照組無死亡。

2.2 小鼠照射后空腸組織ARL6lP1蛋白表達

與正常對照組相比，小鼠照射后1和3 d，照射組空腸組織中ARL6IP1蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；照射后7和14 d，照射組空腸組織中ARL6Ip1蛋白表達與正常對照組無顯著差異（圖1）。

Fig.1 Effect of radiation on expression of ARL6lP1 in jejunum of mice by Western blotting.The mice were exposed to 15 Gy of abdominal radiation.IA：integrated absorbance；B was the semi-quantitative result of A.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 Arl6ip1-siRNA轉染效率及Arl6ip1-siRNA轉染對lEC-6細胞ARL6lP1表達水平的影響

siRNA轉染IEC-6細胞后72 h，用流式細胞儀分析siRNA-NC，Arl6ip1-siRNA-132，Arl6ip1-siRNA-249和Arl6ip1-siRNA-565的轉染效率，分別為（89±4）%，（64±9）%，（45±7）%和（88±10）%（n=5）（圖2）。轉染Arl6ip1-siRNA-565后，IEC-6細胞中ARL6IP1蛋白表達水平較siRNA-NC組明顯降低（P＜0.05）；而轉染Arl6ip1-siRNA-132和Arl6ip1-siRNA-249后，IEC-6細胞中ARL6IP1蛋白表達水平與siRNA-NC組無顯著差異（圖3）。

2.4 敲低Arl6ip1對照射后lEC-6細胞存活率的影響

圖4結果表明，照射后24 h，與細胞對照組相比，細胞照射組細胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與細胞照射組相比，siRNA-NC轉染照射組細胞存活率無顯著變化，Arl6ip1-siRNA-565轉染照射組顯著降低（P＜0.05）；與siRNA-NC轉染照射組相比，Arl6ip1-siRNA-565轉染照射組細胞存活率顯著降低（P＜0.01）。照射后48 h，各組細胞存活率變化與照射后24 h基本一致。

2.5 敲低Arl6ip1對照射后lEC-6細胞 γH2AX表達的影響

圖5結果表明，用Arl6ip1-siRNA-565和siRNA-NC慢病毒轉染IEC-6細胞后4 d，進行60Co源γ射線照射3 h。免疫熒光法檢測結果表明，細胞對照組可見少量γH2AX陽性細胞，而細胞照射組和siRNA-NC轉染照射組可見較多散在的γH2AX陽性細胞，Arl6ip1-siRNA-565轉染照射組可見較為密集的γH2AX陽性細胞。經過圖像分析，與細胞對照組相比，細胞照射組γH2AX熒光強度顯著升高（P＜0.05）；與細胞照射組相比，siRNA-NC轉染照射組γH2AX熒光強度無顯著差異，而Arl6ip1-siRNA-565轉染照射組γH2AX熒光強度顯著升高（P＜0.05）。與siRNA-NC轉染照射組相比，Arl6ip1-siRNA-565轉染照射組γH2AX熒光強度顯著升高（P＜0.05）。

Fig.2 lnfection efficiency of different siRNA-LV5（EF-1aF/GFP&Puro）assayed by flow cytometry.IEC-6 cells were infected with siRNA-NC，Arl6ip1-siRNA-132，Arl6ip1-siRNA-249 or Arl6ip1-siRNA-565 lentivirus for 3 d.The infection efficiency was detected with flow cytometry by calculating the percentage of green fluorescent protein（GFP）positive cells.B was the quantitative result of A.±s，n=6.

Fig.3 Protein expression of ARL6lP1 in Arl6ip1 knockout lEC-6 cells assayed by Western blotting.See Fig.2 for the cell transfection.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with siRNA-NC group.

Fig.4 Effect of Arl6ip1 knockdown on survival rate of lEC-6 cells after radiation assayed by cell counting Kit 8.See Fig.2 for the cell transfection.IEC-6 cells were exposed to 15 Gy of radiation.Cell survival rate（%）=［A450 nmof the test well-A450 nmof the blank well］/［A450 nmof the cell control well-A450 nmof the blank well］.±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with cell radiation group；△△P＜0.01，compared with siRNA-NC+ratiation group.

Fig.5 Effect of Arl6ip1 knockdown on expression of phosphorylated histone H2AX（ γH2AX）in lEC-6 cells after radiation assayed by immunofluorescence.See Fig.2 for the cell transfection and Fig.4 for the cell radiation.DNA damage was measured by the fluorescence intensity of γH2AX-positive cells 3 h post radiation.B was the quantitative result of A.±s，n=6.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with cell radiation group；△P＜0.05，compared with siRNA-NC+radiation group.

3 討論

RⅢ主要包括小腸上皮細胞損傷和炎癥反應2個過程［3-4］，其中小腸上皮細胞損傷和修復受多種因素影響，如腸道免疫應答［7］、P53通路調控［18］和局部循環系統改變［19］等。前期單細胞轉錄組測序結果發現，小腸上皮細胞損傷和修復在RⅢ中具有重要作用，其中Arl6ip1基因在小腸上皮細胞存在表達，且在照射后存活細胞中特異性高表達。本研究制備小鼠RⅢ模型，初步探索ARL6IP1蛋白在RⅢ前后表達水平的變化規律，并利用siRNA干擾技術成功構建Arl6ip1基因敲低的IEC-6細胞，通過觀察Arl6ip1基因敲低對電離輻射致細胞DNA損傷和存活的影響，探索Arl6ip1基因在電離輻射致細胞損傷過程中的作用。

動物實驗結果表明，在小鼠RⅢ模型中，照射后1和3 d，空腸組織中ARL6IP1蛋白表達顯著下降。本課題組單細胞轉錄組測序結果顯示，Arl6ip1基因在小腸上皮細胞中高表達，結合既往研究結果，照射后3 d小腸上皮細胞凋亡和壞死，存活細胞減少［3］。由此推測，可能是由于RⅢ導致小腸上皮存活細胞數量下降，導致小腸組織中ARL6IP1表達下調。在照射后7和14 d，損傷的腸道黏膜逐漸修復，腸上皮存活細胞數增多，從而使腸道ARL6IP1蛋白表達逐步回升。上述結果表明，在RⅢ早期，腸上皮存活細胞中ARL6IP1表達雖然上調，但小腸組織中ARL6IP1表達下調。

細胞實驗結果表明，與細胞照射組和siRNA-NC轉染照射組相比，Arl6ip1-siRNA-565轉染照射組中γ-H2AX表達顯著上升，細胞存活率顯著下降，表明照射可引發IEC-6細胞DNA損傷，而敲低Arl6ip1可進一步促進照射對IEC-6細胞DNA損傷。此外，照射能抑制IEC-6細胞存活，Arl6ip1敲低能進一步促進照射對細胞存活的抑制作用。上述結果提示，Arl6ip1低表達可促進照射后細胞DNA損傷，抑制細胞存活，從而加重電離輻射所致小腸上皮細胞損傷，提示ARL6IP1在RⅢ中可發揮抗DNA損傷活性。

電離輻射可直接作用于機體內的生物大分子，引起大分子結構的改變，或通過引發機體內生物分子或水分子的電離或激發，產生大量的自由基，導致DNA等生物大分子的損傷，誘發細胞凋亡［20-23］。本研究結果表明，Arl6ip1下調可促進電離輻射引發的DNA損傷及細胞凋亡，提示通過調控Arl6ip1的表達，可減輕RⅢ早期腸道上皮細胞DNA損傷和細胞凋亡，從而減輕腸道損傷，促進RⅢ的恢復，該結果待后續采用動物實驗進一步驗證。本研究為RⅢ機制和防治靶點研究提供了新思路，對于探索Arl6ip1基因在RⅢ發生中的抗損傷機制研究具有重要意義。