副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008的原核表達及誘導條件的優化

袁倩云，梁夏夏，劉 蕾，郭珊珊，王文彬*

(1．江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005；2．江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；3．江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港 222005)

由副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)引起的食物中毒已居微生物食源性疾病暴發的首位[1]，引起的弧菌病給養殖業造成嚴重的損失[2]。因此，建立一種快速、簡便、高效的副溶血性弧菌檢測方法，對海水養殖中弧菌感染的預防與控制具有重要理論意義和應用價值，也為篩選具有較高免疫保護作用的疫苗候選靶位提供理論基礎[3]。

外膜蛋白是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，是一種典型的由蛋白、多糖和脂質共同構成的磷脂雙分子層結構[4]，其在維持細菌細胞結構穩定、細胞營養吸收及物質交換過程中起著十分重要的作用。部分外膜蛋白具有黏附作用，可作為清除和逃避宿主防御機制的毒力因子[5]，在細菌致病性和免疫性中的作用日益受到重視[6]；部分外膜蛋白具有較好的免疫原性，是一種潛在的診斷抗原[7]。研究發現，外膜蛋白OmpA是宿主免疫系統清除細菌的靶向識別蛋白[8]。外膜蛋白OmpK制備多株用于檢測副溶血性弧菌的單克隆抗體具有高度的靈敏性，開發了一種快速、靈敏、簡便的副溶血性弧菌檢測方法[9]。外膜蛋白OmpU具有免疫交叉保護性，可以作為弧菌廣譜疫苗的候選抗原[10]。外膜蛋白OmpC具有很好的免疫原性[11]。免疫候選抗原通過純化重組蛋白或在異源載體中表達的蛋白亞基制成，具有安全性和特異性，因此被廣泛用作魚類弧菌的檢測和預防。

本實驗室前期篩選出17種保守性大于92%的差異性副溶血性弧菌外膜蛋白。其中，外膜蛋白VP1008在弧菌屬中具有廣泛保守性，具有作為弧菌免疫檢測抗原的潛力。目前，關于副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008的生物學功能及重組表達的研究報道較少，其作為診斷抗原和疫苗抗原的價值仍不清楚。因此，作者以副溶血性弧菌為研究主體，運用蛋白質組學技術篩選及鑒定外膜蛋白VP1008，進行原核誘導表達，優化了誘導表達條件[IPTG濃度、起始菌液濃度(OD600)、誘導溫度、誘導時間]，為制備VP1008多克隆抗體，研究VP1008的結構、功能及免疫原性奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3) 和原核表達載體pET-28a(+)，本實驗室保存；副溶血性弧菌(CICC 21617)，中國工業微生物菌種保藏管理中心。

限制性內切酶NcoⅠ和XhoⅠ，寶生物工程有限公司；牛血清蛋白(BSA)，Sigma公司；DNA Marker、雙色預染蛋白 Marker、膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、卡那霉素、異丙基硫代-β-D半乳糖苷、SDS-PAGE凝膠電泳所需試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；其它化學試劑，上海國藥化學試劑有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫療生物儀器公司；單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；水平搖床、核酸電泳儀，北京六一儀器廠；高速冷凍離心機，湖南赫西儀器；超聲波破碎儀，上海領成生物科技；DGGE變性梯度凝膠電泳儀、凝膠成像儀，伯樂公司；磁力攪拌器，舟山海源公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 外膜蛋白VP1008的結構模擬、生物信息學分析和目的基因擴增

從NCBI數據庫中下載VP1008氨基酸序列，通過Swiss-Modle在線服務器進行結構模擬。用Mega 7(version:7.0.26)軟件結合NCBI數據庫構建系統發育樹，在NCBI數據庫中Blast檢索出與VP1008同源性較高的10個不同的副溶血性弧菌外膜蛋白和4個弧菌屬外膜蛋白，序列對比分析后用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)進行建樹。從NCBI數據庫中下載VP1008的核苷酸序列，以此為模板，在目的基因序列上插入限制性酶切位點XhoⅠ、NcoⅠ后，使用Premier 5.0軟件設計上下游引物，目的基因擴增參照文獻[12]。

1.3 重組質粒的構建、篩選與鑒定

將純化后的目的基因和載體pET-28a(+)質粒分別用限制性核酸內切酶XhoⅠ和NcoⅠ進行酶切后，通過T4連接酶于16 ℃連接過夜，重組質粒的構建、篩選與鑒定參照文獻[12]。

1.4 重組外膜蛋白VP1008的誘導表達及表達條件的優化

重組外膜蛋白VP1008的誘導表達參照文獻[12]。

為提高重組外膜蛋白的表達量，對誘導劑IPTG濃度、OD600、誘導溫度、誘導時間進行優化。將IPTG濃度設計為0.2 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1，37 ℃搖床振蕩培養至對數生長期OD600為 0.6，誘導時間為12 h；OD600設計為0.4、0.6、0.8，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1，誘導溫度為37 ℃，誘導時間為12 h；誘導溫度設計為16 ℃、28 ℃、37 ℃、42 ℃，OD600為0.6，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1，誘導時間為12 h；誘導時間設計為6 h、12 h、18 h，OD600為0.6，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1，誘導溫度為37 ℃。菌體超聲破碎、離心，分別收集上清和沉淀，進行10% SDS-PAGE電泳表征，分析蛋白表達情況。

2 結果與討論

2.1 外膜蛋白VP1008的結構類型及生物進化樹分析

VP1008為預測的外膜蛋白，相關研究較少。通過Swiss-Modle模擬結構，VP1008具有典型的β-桶狀結構，說明是副溶血性弧菌外膜蛋白。系統發育樹(圖1)表明，VP1008在副溶血性弧菌菌株間同源性較高，在弧菌屬內僅與部分弧菌有一定的同源性。

圖1 VP1008系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of VP1008

2.2 目的基因擴增與重組質粒的構建、篩選與鑒定

PCR驗證結果表明，4個單菌落擴增出與VP1008基因大小相近的條帶，經雙向測序后與原序列進行比對，符合度均在98.5%以上，表明重組質粒構建成功。

2.3 重組外膜蛋白VP1008的表達

重組外膜蛋白VP1008經SDS-PAGE凝膠電泳分析發現，沉淀在約為40 kDa出現了明顯的特異性目的條帶，與目的蛋白理論分子量39.325 kDa相符；而上清液中無目的條帶。表明，重組外膜蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中。

2.4 重組外膜蛋白VP1008表達條件的優化

2.4.1 IPTG濃度

挑取陽性重組質粒單菌落置于液體培養基中，37 ℃搖床振蕩培養至OD600為0.6，誘導時間為12 h，考察IPTG濃度對蛋白表達量的影響，結果見圖2。

由圖2可知，隨著IPTG濃度的增加，蛋白表達量升高，但IPTG有一定的毒性，IPTG濃度過高會影響蛋白的表達[13]，當IPTG濃度為1.0 mmol·L-1時，蛋白表達量最高。因此，確定最優IPTG濃度為1.0 mmol·L-1。

2.4.2OD600的優化

固定IPTG濃度為1.0 mmol·L-1、誘導溫度為37 ℃、誘導時間為12 h，考察OD600對蛋白表達量的影響，結果見圖3。

M.DNA分子量標準 1，2.0.2 mmol·L-1IPTG誘導的上清、沉淀3，4.0.5 mmol·L-1IPTG誘導的上清、沉淀 5，6.0.8 mmol·L-1IPTG誘導的上清、沉淀 7，8.1.0 mmol·L-1IPTG誘導的上清、沉淀

M.DNA分子量標準 1，2.OD600 為0.4誘導的上清、沉淀 3，4.OD600為0.6誘導的上清、沉淀 5，6.OD600 為0.8誘導的上清、沉淀

由圖3可知，隨著OD600的增加，蛋白表達量升高，當OD600增至0.6時，細菌處于對數生長期，數量增加極快，活性最高，蛋白表達量最高；當OD600繼續增至0.8時，蛋白表達量沒有明顯升高，基本趨于穩定。因此，確定最優OD600為0.6。

2.4.3 誘導溫度的優化

固定OD600為0.6、IPTG濃度為1.0 mmol·L-1、誘導時間為12 h，考察誘導溫度對蛋白表達量的影響，結果見圖4。

由圖4可知，隨著誘導溫度的升高，蛋白表達量升高不明顯；誘導溫度為16 ℃、42 ℃時，蛋白表達量較少；誘導溫度為28 ℃時，蛋白表達量略微升高；當誘導溫度為37 ℃即大腸桿菌的最適生長溫度時，蛋白表達量最高。因此，確定最優誘導溫度為37 ℃。

2.4.4 誘導時間的優化

固定OD600為0.6、IPTG濃度為1.0 mmol·L-1、誘導溫度為37 ℃，考察誘導時間對蛋白表達量的影響，結果見圖5。

M.DNA分子量標準1，2.16 ℃時誘導的上清、沉淀3，4.28 ℃時誘導的上清、沉淀5，6.37 ℃時誘導的上清、沉淀7，8.42 ℃時誘導的上清、沉淀

M.DNA分子量標準 1，2.誘導6 h的上清、沉淀 3，4.誘導12 h的上清、沉淀 5，6.誘導18 h的上清、沉淀

由圖5可知，隨著誘導時間的延長，蛋白表達量逐漸升高，當誘導時間為12 h時，蛋白表達量最高；誘導時間延長到18 h時，蛋白表達量沒有明顯升高。因此，確定最優誘導時間為12 h。

3 結論

成功構建了VP1008原核表達系統，確定重組外膜蛋白VP1008的最優誘導條件為：IPTG濃度1.0 mmol·L-1、OD6000.6、誘導溫度37 ℃、誘導時間12 h，重組蛋白以包涵體的形式存在。制備的重組外膜蛋白VP1008的表達量較高，為下一步制備該蛋白多克隆抗體，研究該蛋白的結構、功能、免疫原性奠定了基礎。