COL2在絕經后女性中的表達與骨質疏松相關性的研究

韓衍龍 米爾阿里木·木爾提扎 它依爾江·舉來提 趙巍 哈巴西·卡肯 王利

新疆維吾爾自治區人民醫院骨科中心關節老年病區，新疆 烏魯木齊 830000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨骼疾病，其特點是骨質密度降低、骨質脆性增大、骨組織結構退化致骨量減少和容易骨折[1-2]。引起骨質疏松癥的因素有多種，例如雌激素缺乏、年齡及遺傳因素等[3]。世界衛生組織(WHO)公布有關骨質疏松癥的數據顯示，OP影響了美國、歐洲、日本和中國約7500萬人[4]。絕經后女性是易患骨質疏松癥的高危人群，其重要原因就是雌激素缺乏[5]。骨質疏松又大大增加髖部骨折的發生率，進而降低患者的生活質量，增加致殘率，甚至增加死亡率。

膠原蛋白是人體細胞外間質的主要成分之一，是人體蛋白質大家族成員，目前一共有14種類型，共兩大類：纖維性膠原和非纖維性膠原，分布特點及功能各不相同。目前研究表明，Ⅱ型膠原蛋白(Collagen Ⅱ，COL2)主要是軟骨細胞分泌合成，大多數見于骨骼、關節、肌腱等組織，Ⅱ型膠原蛋白是正常軟骨細胞分泌的主要膠原蛋白，Ⅰ型膠原蛋白非常罕見[6]，骨性關節炎病程中的重要環節是Ⅱ型膠原蛋白形成的網狀結構遭到破壞[7-8]，進而引起軟骨生物力學、生物化學等一系列變化[9-11]。相關研究[12]表明，肌肉減少癥的主要特征就是 II 型肌纖維和運動神經元的數量減少，嚴重影響了肌肉強度及身體平衡能力。因此，肌肉減少癥患者具有較高的跌倒風險性，特別是骨量減少及骨質疏松的患者，這是發生髖部骨折的重要原因。但至今有關Ⅱ型膠原蛋白與骨質疏松的相關性未見報道，本研究通過骨量正常、骨量減少、骨質疏松和嚴重骨質疏松4組患者骨骼肌中Ⅱ型膠原蛋白表達的差異性，探討Ⅱ型膠原蛋白與骨質疏松之間的相關性。

1 材料和方法

1.1 入選對象

選取自2017年1月至2019年12月在新疆維吾爾自治區人民醫院骨科中心關節老年病區就診的絕經后女性髖部骨折患者共60例，平均年齡(64.5±11.4)(48～89)歲，按照雙能X線骨密度(DXA)檢測分為骨量正常、骨量減少、骨質疏松和嚴重骨質疏松4組，每組各15例。

1.2 納入、排除標準

納入標準：①絕經后女性；②髖部骨折；③行手術治療(人工全髖關節置換術或內固定術“動力髖鋼板內固定術”(DHS)或閉合復位髓內釘固定術(PFNA)；④患者自愿參加、知情同意，并簽署知情同意書。

排除標準：①吸煙、飲酒者；②近3個月服用影響骨代謝的藥物(如糖皮質激素)者；③患有影響骨骼肌肉代謝的疾病(如糖尿病、腫瘤、甲狀旁腺功能亢進、類風濕關節炎等)者；④合并有嚴重疾病(如冠心病、慢性阻塞性肺疾病、肺心病、肝腎功能不全、血液病)者；⑤患有其他骨骼肌肉疾病者。

1.3 方法設計

術前行雙能量X線骨密度(DXA)檢測，分為骨量正常、骨量減少、骨質疏松和嚴重骨質疏松4組，術中取患者相同部位的股外側肌肉組織，放入-80 ℃存放待測，然后行RT-PCR及免疫組化檢測COL2的mRNA及蛋白的表達水平，并對結果行統計學分析。

1.4 實驗方法

標本制作：術中取患者相同部位的無損傷的股外側肌肉組織兩份，一份肌肉組織切成3 mm ×3 mm ×3 mm，置于-80 ℃存放，用于RT-PCR檢測；另一份肌肉組織切成5 mm ×5 mm ×5 mm，多聚甲醛固定，石蠟包藏，用于免疫組化檢測。

RT-PCR檢測mRNA：①Trizol法提取RNA，取微量分光光度計對溶解后的RNA 2 μL進行測定OD260、OD280和OD260/OD280值，并且根據結果計算出RNA的純度和濃度。

②反轉錄成cDNA，按照表1進行反轉錄。③RT-PCR檢測，按照表2、3進行RT-PCR檢測。

表1 反轉錄反應體系Table 1 The reverse transcription system

表2 RT-PCR檢測引物信息Table 2 The primers for RT-PCR

表3 RT-PCR反應體系(μL)Table 3 The RT-PCR system(μL)

免疫組化(IHC)檢測：用65 ℃恒溫箱對組織切片進行烘烤1.5～2 h；取新鮮組織切片，分兩次放入二甲苯中各浸泡10 min；放入無水酒精靜止5 min，再置于95 %、90 %、80 %、70 %乙醇、蒸餾水各靜放5 min；把 0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)放入高壓鍋中煮沸，然后把切片放入修復液中，一直加熱到排氣，斷火，在緩沖液中浸泡10 min，然后冷卻；去除內源性過氧化物酶；用PBS浸泡不銹鋼提籃；按照合適比例對一抗進行稀釋(表4)，然后在每張片子里加入稀釋后的一抗50 μL，放在4 ℃環境中過夜(第二天需室溫復溫20 min)；將辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗50 μL放入，在室溫中靜放20 min；再把不銹鋼提籃放在PBS里浸泡；加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液50 μL，放在室溫中孵育20 min；再次把不銹鋼提籃放在PBS里浸泡；用DAB進行顯色3～10 min，利用顯微鏡觀察染色程度(DAB顯色為棕色顆粒狀沉淀)，并記錄；放在自來水里將顯色終止3 min；蘇木精復染3 min，鹽酸酒精分化數秒(1～2 s)；自來水中反藍5 min；分別在蒸餾水、70 %、80 %、90 %、95 %乙醇中浸泡3 min，再在無水乙醇Ⅰ、Ⅱ，分別浸泡5 min；在二甲苯Ⅰ、Ⅱ，分別浸泡5 min；中性樹膠封片；37 ℃烤片過夜。

表4 抗體稀釋比例Table 4 The ratio of antibody dilution

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 RT-PCR檢測COL2 mRNA結果

RT-PCR檢測COL2 mRNA結果顯示，由圖1可知COL2 mRNA在骨量正常組、骨量減少組、骨質疏松組和嚴重骨質疏松組4組中的表達量呈逐漸減少趨勢，骨量正常組中COL2 mRNA的表達水平與骨量減少組之間的差異無統計學意義(P>0.05)；COL2 mRNA在骨量減少組的表達水平明顯高于骨質疏松組，且差異有統計學意義(P<0.05)；骨質疏松組中的COL2 mRNA的表達水平明顯高于嚴重骨質疏松組，且差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 COL2 mRNA表達水平與骨量分組之間的關系Fig.1 The correlation between COL2 mRNA expression level and bone mass grouping

2.2 免疫組化(IHC)檢測COL2蛋白表達

免疫組化檢測COL2蛋白的表達結果顯示，COL2蛋白表達情況被染為棕褐色，由圖2可知，棕褐色顆粒數目在骨量正常組、骨量減少組、骨質疏松組和嚴重骨質疏松組4組中的表達量呈逐漸減少趨勢，在骨量正常組和骨量減少組的表達情況差異無統計學意義；COL2蛋白在骨量減少組的表達明顯強于骨質疏松組，而在骨質疏松組的表達明顯強于嚴重骨質疏松組。

圖2 免疫組化檢測COL2蛋白的表達結果Fig.2 The results of protein level of COL2 detected with immunohistochemistry

3 討論

骨質疏松癥( osteoporosis，OP) 是一種全身性骨骼疾病，使骨質密度降低、骨強度下降、骨質脆弱，從而容易發生骨折[13]。在解剖位置上，肌肉與骨骼相互毗鄰，它們的旁分泌和內分泌調節擁有著共同通路，分子信號調節通路相似，并且有著相似的治療靶點及藥物[14]。肌肉纖維減少和骨質疏松共同作用影響患者身體的平衡，使患者容易發生跌倒，增加脆性骨折的概率，大大降低患者的生活質量，尤其是絕經后女性。眾所周知，絕經后女性發生骨質疏松的概率會明顯上升，進而絕經后女性是發生髖部骨折的高危人群。隨著人口老齡化逐年發展，有專家預計骨質疏松性髖部骨折的發生會在2050年呈指數級增長[15]。相關研究預測，到2050年，髖部骨折的數量將從2018年的1 124 060例增加到2 563 488例[16]。肌肉與骨骼不同之處在于，人的年齡在25歲前機體的肌肉量就已達到頂峰時期，隨著年齡增長，肌纖維數量也在逐年減少，其中肌肉質量的下降程度明顯低于肌肉強度和肌肉力量的下降程度[17]。肌肉減少癥很早以前就被人提出過，所謂肌肉減少癥也稱為肌少癥(Sarcopenia)，是指與年齡相關的全身肌量減少和/或肌肉強度下降或肌肉生理功能減退，導致身體平衡能力及活動程度明顯下降的一種退行性疾病[18]。肌肉減少癥與骨質疏松癥是導致絕經后女性患者發生髖部骨折的兩大重要因素，大大降低了絕經后女性的生活質量，增加了死亡率。

髖部骨折對患者身心健康產生嚴重有害影響，在經濟和精神方面，對患者家庭帶來巨大負擔，對患者本人造成重大心理創傷，對社會產生較大的負面影響。肌肉減少癥主要是Ⅱ型肌肉纖維的減少，并伴有運動神經元數量減少，導致肌肉含量及功能受到嚴重的有害影響，進而引起步速減慢、身體搖擺性增加，最終造成人體平衡能力大大減弱，增加了跌倒的風險，而跌倒往往又是髖部骨折的直接誘因[19-20]。為預防髖部骨折的發生，降低其發生率，必須找到干預的靶點。現有文獻報道，Ⅱ型膠原蛋白生成主要由軟骨細胞分泌，而軟骨細胞普遍存在于肌腱、關節、骨骼等組織，至今未見文獻報道Ⅱ型膠原蛋白在骨骼肌中表達水平與骨質疏松之間的相關性。

本研究選取絕經后發生髖部骨折的女性患者60例，并且都行手術治療，術中同一個術者取相同部位的無損傷的股外側肌肉組織，RT-PCR結果顯示在骨量正常和骨量減少兩組中COL2 mRNA的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；然而在骨量減少組中COL2 mRNA的表達水平明顯高于骨質疏松組(P<0.05)；嚴重骨質疏松組中的COL2 mRNA的表達水平明顯低于骨質疏松組(P<0.05)。免疫組化(IHC)檢測結果顯示，COL2蛋白的表達在骨量正常和骨量減少兩組差異無統計學意義(P>0.05)，COL2蛋白在骨質疏松組中的表達明顯弱于骨量減少組(P<0.05)，而在嚴重骨質疏松組中的表達明顯弱于骨質疏松組(P<0.05)。兩個實驗結果可得出，COL2是與骨質疏松呈負相關性的，COL2又是肌肉減少癥的主要影響因素，COL2是與骨質疏松及肌肉減少癥相關的因素，然而骨質疏松和肌肉減少癥共同影響著絕經后女性的身體的平衡能力，導致患者易跌倒，進而增加髖部骨折的發生機率，大大降低患者的生活質量[21-22]。

Binkley 等[23]根據對肌肉和骨骼的研究，以及結合對肌少癥和骨質疏松癥的了解，提出了 “肌少-骨質疏松癥”的概念，主要是指臨床確診為骨質疏松癥的患者同時伴有肌肉質量和/或功能的下降。結合我國的國情[24-25]，建議相關評估標準如下：①DXA評估骨量和肌肉量；② 測試步速，以0.8 m/s為臨界值；③在靜息情況下評估優勢手握力( AWGS 推薦的標準)。依據DXA結果，若肌肉量<-2 SD(參照青年健康人峰值)可診斷為肌量減少，骨量<-2.5 SD(健康人峰值)可診斷為骨質疏松癥，同時滿足“肌少癥”和“骨質疏松癥”的患者，診斷可以考慮為“肌少-骨質疏松癥”。此病的最大危害就是增加了骨質疏松性髖部骨折相關并發癥的發生，但至今對“肌少-骨質疏松癥”的認識不夠充分，還需更多的臨床及基礎實驗研究，目前也沒有有效的治療藥物，還不能夠采取有效的干預措施來預防及治療此病，這就需要更多的學者及研究人員去尋找有效的治療或干預靶點，此研究從Ⅱ型肌肉纖維的減少是肌肉減少癥的主要特征著手，來探討Ⅱ型膠原蛋白與骨質疏松的相關性，從而尋找更有力的預防或治療肌肉減少癥和骨質疏松的有效靶點，本研究的結果顯示，COL2與骨質疏松呈間接負相關性，而COL2與肌肉減少癥呈直接正相關性。

綜上所述，Ⅱ型膠原蛋白代謝指標可以有效地預測肌肉纖維和骨質疏松的情況，可反映骨代謝水平，可評估肌肉減少和骨質疏松的程度，預測骨折發生的危險性，從而采取有效的預防措施，減少絕經后女性患者的髖部骨折發生率，甚至降低致殘率和死亡率。另外，Ⅱ型膠原蛋白可能是研究絕經后女性骨質疏松患者髖部骨折的治療靶點，但還需更多的臨床及基礎實驗研究進一步的驗證。

本研究的不足之處，此研究的樣本量有點少，不能夠充分地證明Ⅱ型膠原蛋白與骨質疏松之間的相關性，還需更大的實驗樣本量，更多的實驗數據進一步驗證此研究結果。