基于網絡藥理學和分子對接探討黃芪治療特發性肺纖維化的分子機制

趙夢雅，姜夢筆，楊 欣，張浩宇，劉 楊，黃 高，陳蕾蕾*

1貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴陽 550025；2廣州中醫藥大學番禺區中心醫院，廣州 510006

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種以逐漸加重的呼吸困難和肺功能不可逆下降為特征的慢性、進行性肺間質疾病。此病在發展過程中受炎癥反應、肺損傷、免疫反應和纖維生成等要素的綜合影響，導致機體出現肺泡損傷、成纖維細胞增殖以及細胞外基質(ECM)大量沉積等病理表現[1]。我國目前IPF患病人數呈逐年增加的趨勢，且預后不良[2]。目前,西醫治療特發性肺纖維化多以糖皮質激素、細胞毒藥物和免疫抑制劑為主[3]。大量臨床和試驗研究表明中醫藥對IPF的多個病理環節均有明顯的改善作用，可提高患者的生存質量，降低死亡率，具有良好的應用前景[4]。基于數據挖掘分析，中醫藥在治療此類疾病過程中補益藥的使用頻率高達55%[5]，其中黃芪的使用頻次為148次[6]，位列第一，以此說明黃芪在特發性肺纖維化的治療中發揮了重要作用。

黃芪(Astragali Radix)味甘，性微溫，歸脾、肺經，具有補脾升陽、益肺固表等功效，常用于扶正固本，《神農本草經》載其“主治癰疽…補虛”，是臨床防治多臟器纖維化的主要中藥之一。黃芪活性成分較多，主要含黃芪皂苷、黃芪多糖、黃酮類化合物及三萜類物質。目前，黃芪的化學成分及活性成分受到廣泛關注，隨著各方對黃芪藥理作用研究的不斷深入，黃芪甲苷、黃芪多糖、黃芪總皂苷[7]及黃芪注射液[8]，已在IPF的治療中取得療效。因此本研究以黃芪化學成分為切入點，通過網絡藥理學及分子對接技術，探討黃芪治療IPF的關鍵活性成分及調節的靶點，為開發及臨床用黃芪提供理論依據。具體流程見圖1。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

本次研究過程中所使用和涉及的數據庫及軟件見表1。軟件運行于Windows操作系統平臺。處理器為Inter(R) Core(TM) i5-10400 CPU@2.90GHz，64位操作系統。使用的相關軟件已授權或開源軟件。

1.2 篩選黃芪化學成分及靶點

基于中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)以“黃芪”為關鍵詞進行化學成分檢索。基于Swiss Target Prediction預測黃芪化學成分的潛在靶點。根據黃芪所有化學成分的SMILES進行預測，在線打開Swiss Target Prediction，選擇“old.swisstargetprediction.ch”依次上傳黃芪活性成分的SMILES結構式，選擇“Homo sapiens”，其他參數默認，點擊“Submit”即可預測靶點。

1.3 特發性肺纖維化疾病靶點篩選

基于人類基因數據庫GeneCards和比較毒物基因組學數據庫CTD兩個平臺，輸入關鍵詞“idiopathic pulmonary fibrosis”，收集與特發性肺纖維化相關的疾病靶點，使用FunRich 3.1.3軟件將兩個數據庫所得的疾病靶點進行映射取交集構建疾病靶點庫，再與預測所得的活性成分靶點取交集，最終篩選出黃芪治療特發性肺纖維化的潛在作用靶點。

1.4 GO和KEGG通路分析

利用R語言中的clusterProfiler包進行GO和KEGG分析，對潛在作用靶點的生物學過程(biological process，BP)，細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3個方面分別進行富集分析，首先在R軟件安裝Biocondoctor軟件包“org.Hs.eg.db”并運行，將黃芪治療特發性肺纖維化的關鍵靶基因轉換成entrez ID。然后在R軟件安裝clusterProfiler包，根據已轉換的entrez ID，設定種為人源，選擇P(P-value)<0.05且校正的P(P.adjust)<0.05為閾值進行關鍵靶基因GO和KEGG的富集分析，并將結果以氣泡圖的形式輸出。

1.5 蛋白相互作用(PPI)分析

STRING數據庫是一種檢索蛋白相互作用的數據庫，收集了包括實驗驗證得到的以及通過生物信息學方法預測得到在內的大量PPI數據。打開STRING數據庫，選擇“multiple proteins”，將黃芪與特發性肺纖維化的共同作用靶點導入，將Organism設置為“Homo”進行篩選，選擇中等置信度為0.400，獲取PPI關系，建立PPI網絡，應用R軟件包，繪制條形圖展示關鍵靶點在網絡中相互作用的頻次(degree)。

1.6 黃芪活性成分和作用靶點的分子對接驗證

從蛋白質晶體結構數據庫RCSB中獲取前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2，PDB-ID：3W15)，血管內皮生長因子A(VEGFA，PDB-ID：3BDY)，基質金屬蛋白酶-9(MMP-9，PDB-ID：1GKC)，信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3，PDB-ID：4E68)，表皮生長因子受體(EGFR，PDB-ID：1M17)，PDB格式保存。后將其導入SYBYL 2.1.1軟件中進行預處理，包括提取配體小分子、去除水分子、加氫等。將從PubChem數據庫下載的活性化合物3D結構的sdf文件進行能量優化，利用SYBYL 2.1.1中的Surflex-Dock模塊將對應的化合物與蛋白進行分子對接，利用打分函數進行評價。采用藥物分子設計模擬SYBYL 2.1.1軟件的Surflex-Dock和模塊完成分子對接研究。初始篩選采用標準模式進行對接，修飾后的小分子與靶標蛋白進行半柔性對接，對接過程中閾值參數0.5，其他參數為系統缺省值。

1.7 實驗驗證

1.7.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠40只，體質量200 ± 20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號為SCXK(京)2019-0008，于貴州中醫藥大學實驗動物中心適應性飼養一周，自由飲食飲水。

1.7.2 藥物、試劑與儀器

1.7.2.1 藥物

黃芪飲片(批號2008002，安國市彤康藥業有限公司)；葉酸(批號F809516-5 g，質量分數97%，上海麥克林生化科技有限公司)；博來霉素(國藥準字H20055883，規格1.5萬單位/支，海正輝瑞制藥公司)。

1.7.2.2 試劑

蘇木精-伊紅染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號G1120)；Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號G1340)；大鼠白細胞介素17(IL-17)ELISA試劑盒(批號MM-0088R1，江蘇酶免實業有限公司)；大鼠基質蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9/Gelatinase B)ELISA試劑盒(批號MM-0055R1，江蘇酶免實業有限公司)

1.7.2.3 儀器

組織包埋機(EG1150 H，德國Leica)；石蠟切片機(KD3368，浙江金華科迪有限公司)；光學顯微鏡(DP73，日本OLYMPUS株式會社)；高速冷凍臺式離心機(x-30R BECKMAN COULTER)；生化培養箱(SPX-150A，蘇州威爾實驗用品有限公司)；多功能酶標儀(1510-01061C Thermo Fisher)。

1.7.3 實驗方法

1.7.3.1 模型制備及分組

SPF級SD大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、葉酸治療組及黃芪治療組，每組10只，除空白對照組外其余大鼠按體質量用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，觀察呼吸及反應，穩定后將大鼠仰臥30°固定于手術臺上，酒精消毒頸部皮膚，剪刀縱向切開頸部皮膚1 cm左右，手術鑷逐層鈍性分離頸部組織，直至氣管暴露。模型對照組及藥物處理組大鼠按體質量氣管注射博來霉素(bleomycin，BLM)，濃度為1 mg/mL(生理鹽水溶解)，給藥劑量為5 mg/kg，隨即將大鼠頭部抬起直至大鼠完全直立，使博來霉素注射液均勻分布于兩肺，縫合皮膚，放入鼠籠保溫待其蘇醒，醒后正常飲水進食，觀察大鼠一般狀況。

1.7.3.2 給藥及標本采集

術后連續飼養3天，而后開始灌胃給藥。根據《中國藥典》2020版，稱取黃芪30 g，8倍水量浸泡30 min，先武火后文火煎煮3次，合并濃縮濾液。給藥劑量參考徐叔云主編《藥理實驗方法學》，按體表面積和人與動物臨床劑量倍數進行換算，得出大鼠的給藥等效劑量黃芪3.15 g/kg，葉酸0.04 mg/kg。每天灌胃1次，持續28天，末次給藥1 h后將各組大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，腹主動脈采血處死，摘取左肺組織，PBS溶液清洗殘血，置于4%多聚甲醛中固定，4 ℃冰箱保存，用于組織病理學檢測。采血管放入離心機，3 000 rpm離心10 min得到血清，-80 ℃冰箱凍存。

1.7.3.3 HE染色和Masson染色

將4 ℃冰箱固定24 h后的肺組織取出，進行常規石蠟包埋操作，即自來水沖洗過夜、由低到高濃度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋，4 ℃冰箱保存過夜，取出包埋組織以5 μm厚度切片，具體染色步驟按照試劑盒說明書內容進行操作，染色結束后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察HE染色的炎癥反應情況及Masson染色的膠原增殖情況。

1.7.3.4 酶聯免疫吸附法檢測大鼠血清中IL-17、MMP-9蛋白的表達

酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血清中IL-17及MMP-9蛋白表達水平。使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中各細胞因子的含量，按照試劑盒說明書在室溫下規范操作即可。首先稀釋標準品，然后進行加樣、37 ℃溫育30 min、配制洗滌液、洗滌5次、加酶、再次37 ℃溫育30 min并洗滌5次、加顯色劑顯色、加終止劑終止反應，最后使用450 nm波長的酶標儀迅速測定各孔的吸光度(OD值)，將測定結果以標準品OD值為橫軸，濃度為縱軸求得標準曲線的直線回歸方程式，將測得的各組樣品本OD值代入方程式，得出樣品稀釋后的濃度，將其乘以稀釋倍數則可得到樣品的實際濃度。

1.7.3.5 數據分析

2 結果

2.1 黃芪抗特發性肺纖維化靶標分析

中藥黃芪基于TCMSP數據庫篩選出87個化學成分，87個化學成分獲得1 305個靶基因。基于GeneCards獲得713個IPF的相關基因，基于CTD篩選獲得1 981個IPF的相關基因，兩個數據庫共交集272個靶點(圖2A)。272個特發性肺纖維化的相關基因與黃芪化學成分靶基因進行交集，共篩選出25個黃芪抗特發性肺纖維化的靶基因(圖2B和表2)。基于Cytoscape 3.6.1建立黃芪化學成分-靶點網絡模型(見圖2C)。

圖2 黃芪化學成分-靶點-特發性肺纖維化Fig.2 Chemical composition of Astragali Radix-target-idiopathic pulmonary fibrosis

表2 黃芪治療特發性肺纖維化的靶點Table 2 The therapeutic target of Astragali Radix for idiopathic pulmonary fibrosis

2.2 GO和KEGG通路富集分析

25個差異基因的GO富集分析主要是使用R中clusterProfiler包完成，輸出25個差異基因的GO前10項(見圖3A～C)，其中橫坐標GeneRatio表示輸入的基因占整體基因的百分之比(%)。圓圈的大小代表基因的數量，圓圈的顏色代表校正的P值(P.adjust)。結果發現25個靶點參與的生物過程中主要富集于活性氧化代謝，炎癥反應、氧化應激等(P-value < 0.05)；基因主要定位于囊泡腔、內吞囊泡腔(P-value < 0.05)；分子功能主要為內肽酶、絲氨酸型肽酶和金屬肽酶活性等(P-value < 0.05)，如表3所示。

25個靶點涉及29條信號通路(P-value<0.05)，基于R輸出前10項(圖3D)，主要涉及IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、前列腺癌(prostate cancer)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等。

圖3 關鍵靶基因的GO與KEGG通路富集分析Fig.3 Enrichment analysis of GO and KEGG pathways of key target genes

2.3 蛋白相互作用(PPI)網絡的構建

25個靶點使用STRING結合Cytoscape 3.6.1進行PPI分析(見圖4A)，25個靶點關聯密切。利用R語言根據節點的degree繪制蛋白質節點的條形圖，如圖4B所示。Degree>15的節點包括前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)，血管內皮生長因子A(VEGFA)，基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)，信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)和表皮生長因子受體(EGFR)。我們將進行一步采用分子對接進行驗證分析，關鍵靶點的生物學效應見表4。

表4 關鍵靶標的生物學效應Table 4 Biological effects of key targets

圖4 蛋白質-蛋白質相互作用Fig.4 Protein-protein interaction

2.4 分子對接

基于SYBYL 2.1.1分子對接驗證黃芪87個化學成分與5個關鍵靶點的結合情況，對接結果以打分函數T_score≥5為閾值，T_score≥5表示活性成分與靶標蛋白有較好的結合。T_score>7說明具有強烈的結合活性。分子對接結果見表5。黃芪6個化學成分能同時與5個靶點(PTGS2、VEGFA、MMP-9、STAT3、EGFR)有較好的結合(T_score≥5，圖5A)；黃芪6個化學成分能同時與4個靶點(PTGS2、VEGFA、MMP9、STAT3)有較好的結合(T_score≥5，圖5B)；黃芪12個化學成分能同時與3個靶點(PTGS2、VEGFA、MMP-9)有較好的結合(T_score≥5，圖5C)；黃芪19個化學成分能同時與2個靶點(PTGS2、VEGFA)有較好的結合(T_score≥5，圖5D)。同時黃芪中的異鼠李素、黃素、葉酸、落葉松樹脂醇、5′羥基異氟尿嘧啶-2′，5′-di-O-葡萄糖、異黃酮可能是黃芪治療特發性肺纖維化的關鍵成分，我們將進一步深入研究。

表5 黃芪活性成分與靶標蛋白分子對接得分Table 5 The docking score of Astragali Radix active component and target protein

續表5(Continued Tab.5)

圖5 關鍵靶基因與黃芪活性成分對接Fig.5 Docking of key target genes with the active component of Astragali Radix

2.5 黃芪及葉酸對IPF大鼠肺組織炎癥程度和膠原增殖的影響

HE染色結果詳見圖6。空白對照組大鼠肺泡結構清晰完整，肺泡間隔正常，支氣管周圍無充血、滲出等病理表現，也未見明顯的炎癥反應。與空白對照組比較，模型對照組大鼠肺泡結構塌陷粘連、大量融合致數量減少，肺泡壁明顯增厚，毛細血管充血，被大量炎性細胞浸潤，肺纖維結節大量出現，形成肺纖維化瘢痕，出現大片肺實變區域。同模型對照組比較，葉酸治療后有所好轉，但肺泡結構仍然雜亂，組織周圍仍有較多炎性細胞浸潤，組織被破壞程度介于空白組與模型組之間；黃芪治療后改善作用明顯，雖有輕微炎癥反應，但肺泡結構較清晰。

圖6 黃芪和葉酸對IPF大鼠肺組織內炎癥程度的影響(HE染色，×50)Fig.6 Effects of Astragali Radix and folic acid on the degree of inflammation in the lung tissue of IPF rats (HE staining,×50)注：A：空白對照組；B：模型對照組；C：葉酸治療組；D：黃芪治療組，下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Folic acid treatment group;D:Astragali Radix treatment group,the same below.

Masson染色結果詳見圖7。空白對照組大鼠肺泡結構清晰，僅有少量的膠原纖維存在。與空白對照組比較，模型對照組大鼠肺泡結構塌陷皺縮，分布雜亂，膠原纖維增殖明顯，大面積染藍。同模型對照組比較，2個治療組肺組織結構紋理尚為清晰，膠原染色面積有所減少，具有改善作用。

圖7 黃芪和葉酸對IPF大鼠肺組織內膠原增殖程度的影響(Masson染色，×50)Fig.7 Effects of Astragali Radix and folic acid on collagen proliferation in lung tissue of IPF rats(Masson staining,×50)

2.6 ELISA檢測各組大鼠血清中IL-17及MMP-9的表達結果

各組大鼠血清中IL-17、MMP-9含量詳見表6。

表6 各組大鼠血清IL-17、MMP-9含量Table 6 Serum IL-17 and MMP-9 contents of rats in each group = 10)

同空白對照組相比，模型對照組大鼠血清IL-17、MMP-9含量均明顯增高(P< 0.01)。同模型對照組相比，各組大鼠血清IL-17、MMP-9含量均明顯降低(P< 0.01)。2個藥物治療組之間相比，黃芪治療組大鼠血清IL-17、MMP-9含量略低于葉酸治療組。

3 討論與結論

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種原因不明，呈慢性進行性加重且難以逆轉的最常見的肺系疾病[9]，是炎癥反應、肺損傷、免疫反應和纖維生成4個要素的綜合結果。IPF影響全球約300萬人，多發于中老年人，以逐漸加重的呼吸困難和肺功能不可逆下降為特征，預后不良。IPF生存率低，發病率高，被稱為“類腫瘤疾病”，一經確診，患者的生存率會逐年下降，3年的患病時長尚可保證50%的生存率，一旦達到5年，其生存率會下降至僅剩20%[10]，是嚴重危害公眾健康的重大疾病。

黃芪(Astragali Radix)乃補氣之長者，主入肺、脾二經，因其廣泛的作用范圍和明確的功效而成為中醫臨床治療肺纖維化的最常用中藥之一。其化學成分諸多，藥理研究表明黃芪能夠增強免疫功能，具有抗炎、抗菌、抗病毒與抗缺氧等作用，可降低肺中膠原含量[11]，為臨床防治多臟器纖維化的主要中藥之一。目前已發表的文獻中多以黃芪的主要成分黃芪甲苷、黃芪總黃酮等作為主要研究對象，本研究通過生物信息學發現黃芪治療IPF的成分-靶點網絡圖顯示異鼠李素、葉酸等6種化合物與IPF的多個靶點連接度較高，分子對接結果提示這些成分可能在黃芪治療IPF的過程中發揮作用。Zheng等[12]研究證實異鼠李素可通過抑制內質網應激和上皮-間充質轉化保護博萊霉素誘導的肺纖維化；Kawami等[13]研究發現葉酸可能有效抑制mtx誘導的肺損傷；Yao等[14]研究發現巨噬細胞的葉酸受體β表達在IPF中起著致病性作用，針對表達葉酸受體β的巨噬細胞的靶向治療也許是治療IPF的有效方法。

GO和KEGG信號通路分析結果顯示，黃芪治療IPF靶點涉及通路主要與炎癥反應和氧化應激相關，結合分析結果及文獻研究發現IL-17信號通路、EGFR信號通路及HIF-1信號通路與IPF的關聯度較高。Xu等[15]研究發現IL-17可作為肺纖維化輔助診斷指標，預測藥物療效，評估治療效果；Pan等[16]研究發現COPD患者的IL-17表達含量明顯升高，炎癥反應持續；Ma等[17]研究發現CBPP的PEI作為先導化合物，可以通過作用于EGFR和MLC2信號通路，改善肺功能，減輕肺纖維化；Wang等[18]通過研究證實百草枯能夠通過激活HIF-1α信號通路來啟動上皮間質轉化程序，進而誘導肺纖維化的產生。

PPI網絡分析結果發現PTGS2、VEGFA、MMP-9、STAT3及EGFR為關鍵靶點，分子對接結果說明黃芪化學成分能與其有較好的結合，目前，已有研究表明這些靶點在IPF中發揮重要作用。Wang等[19]研究發現益氣溫陽活血利水法能夠改善腎臟損傷，減少纖維化，其機制可能為調控PTGS2/NOX1信號通路進而降低ROS水平減少細胞鐵死亡；BLM誘導大鼠的實驗表明，抑制VEGFR可能會減少纖維化，而VEGF的過表達會加重肺纖維化的進程[20-22]；Luan等[23]研究發現黃芪甲苷可通過降低VEGF、VEGFR2基因表達水平來發揮抗肺纖維化的作用；MMP-9是一種IV型膠原酶，可以降解分布于肺基底膜和間質的膠原ECM等成分，導致肺損傷并啟動肺纖維的發生，Ren等[24]研究發現通肺絡補宗氣方可調節MMP-9/TIMP1失衡，減少FN、Col Ⅳ的過度沉積，進而改善大鼠肺功能，抑制大鼠肺纖維化的發生發展；Wu等[25]研究發現敲除小鼠的STAT3基因，STAT3活性表達增加而減少成纖維細胞的凋亡，更易被BLM誘導發生肺纖維化，提示STAT3蛋白可能促進了肺纖維化的發生。以表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)為代表的EGF生長因子家族及其受體EGFR均在肺纖維化的病程中起著重要作用，Li等[26]研究發現EGFR在博萊霉素染毒大鼠肺組織損傷的不同組別表達水平具有明顯差異，IPF組患者肺組織中的EGFR表達水平明顯高于對照組患者，以此推測IPF的發生可能與EGFR高表達有關。

HE染色和Masson染色結果顯示，IPF大鼠肺內積有大量炎癥細胞，膠原增殖程度明顯增加，肺組織結構發生病理性改變，膠原組織替代了正常的肺泡結構，導致肺的呼吸功能受損，經葉酸和黃芪治療后病理情況有所改善，黃芪的治療效果更為明顯。實驗大鼠血清ELISA結果顯示，模型對照組及2個藥物治療組大鼠血清IL-17、MMP-9含量與空白對照組相比均有明顯增高，其中模型對照組含量最高。2個藥物治療組干預效果顯示，黃芪組大鼠血清IL-17、MMP-9含量明顯低于葉酸組。從趨勢上來看，藥物治療組大鼠血清IL-17、MMP-9含量同模型對照組比均有所降低，說明其能夠通過抑制IPF大鼠血清中IL-17、MMP-9的表達，進而起到抗IPF的作用。

綜上所述，本研究應用生物信息學方法對黃芪治療IPF的成分-靶點進行了分析，通過實驗驗證了黃芪活性成分對于IPF具有治療作用，提示篩選具有合理性，實驗結果初步明確黃芪防治IPF的關鍵靶點及活性成分，黃芪的治療效果優于其活性成分葉酸的治療效果，側面體現黃芪是通過多成分、多靶點、多途徑協同作用治療IPF的特點，但由于中藥化學成分復雜，詳細的作用機制需進一步探究。