丁酸梭菌CB1制劑對肉雞生產性能、腸道形態和菌群的影響

何 菊，李筱雯，崔衛濤，郭 杰，王 純，肖運才，李自力，周祖濤

（1.華中農業大學動物醫學院/湖北省預防獸醫學重點實驗室，武漢 430070；2.湖北華大瑞爾科技有限公司/生物發酵飼料湖北省工程研究中心，武漢 430070）

歐盟委員會在2013年批準丁酸梭菌可作為蛋雞飼料添加劑，中國也于2013年正式將丁酸梭菌納入新飼料添加劑中［1］。研究報道，在種雞和肉雞飼糧中添加丁酸梭菌能有效提高日增重、平均體重、產蛋率和飼料轉化率，促進腸道發育和腸道形態的完整，提高腸道有益菌數量，抑制有害菌，可有效預防腸炎的發生［2，3］。作為飼料添加劑，丁酸梭菌既可單獨使用也可和其他益生菌復合使用，目前丁酸梭菌單獨使用在抗病促生長方面尚難達到與抗生素相同的效果，而與芽孢桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等菌種復合及與低聚糖、中草藥、維生素和酶制劑等添加劑聯合應用顯示出優異的成績［4，5］，因此復合型益生菌添加劑的研究顯得非常必要。為此，本試驗將丁酸梭菌CB1單菌制劑及其與枯草芽孢桿菌復合菌制劑添加于肉雞日糧中，評價丁酸梭菌CB1制劑對肉雞生產性能、腸道形態和菌群的影響，確定丁酸梭菌CB1制劑的益生效果，為肉雞日糧中抗生素替代提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及試驗動物

丁酸梭菌CB1制劑（有效活菌數2×109CFU/g）和復合菌制劑（丁酸梭菌CB1有效活菌數2×109CFU/g，枯草芽孢桿菌TL有效活菌數2×1010CFU/g），由湖北華大瑞爾科技有限公司提供。金霉素（含量為15%）購自金河生物科技股份有限公司。試驗肉雞品種為Cobb500，購自湖北荊州正康家禽有限公司。

1.2 試驗動物與試驗設計

選取1日齡Cobb 500肉雞15 000只，隨機分為5組：A組（基礎日糧）、B組（基礎日糧+50 g/t金霉素）、C1組（基礎日糧+100 g/t丁酸梭菌CB1制劑）、C2組（基礎日糧+200 g/t丁酸梭菌CB1制劑）、D組（基礎日糧+200 g/t復合菌制劑），每組3個重復，每個重復1 000只?；A日糧為玉米豆粕型日糧，參照NRC（1994）營養需要配制，試驗周期為42 d。飼喂試驗在湖北當陽正陽家禽養殖專業合作社開展，同一棟雞舍，網上平養，免疫按常規程序進行。

1.3 生產性能測定方法

生產性能指標包括平均日增重、料肉比和死亡率。試驗期間每天記錄采食量和雞群數量，分別在1、7、14、21、28、35、42 d時，每個重復隨機抽取100只雞進行稱重，稱重在早晨喂料前進行，計算1～21、22～42、1～42 d的平均日增重和死淘率，全程料肉比和死亡率。

1.4 相關指標檢測方法

分別在21 d和42 d，每個重復隨機抽取10只雞，稱取每只采樣雞活體重量并記錄，頸部靜脈放血處死，剖開腹腔采集各項檢測指標所需樣品。

1.4.1 腸道形態檢測 用細線結扎盲腸和回腸中上段一端，取長度約2 cm的腸段，于4%甲醛溶液中固定，經洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋、修蠟、切片等處理步驟，進行常規HE染色。使用日本Nikon 80i生物光學顯微鏡并結合NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統進行測量、觀察和取圖，每張切片觀察選出2～3個典型視野，測定10根完整絨毛的絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD），計算絨毛高度與隱窩深度的比值（VH/CD）。

1.4.2 腸道菌群q RT-PCR檢測目的基因 結扎固定位置和固定長度的回腸、盲腸，置于50 mL滅菌離心管中保存，于無菌超凈臺中稱取腸道內容物。為減少個體差異所帶來的試驗偏差，將每組采集的糞便樣品混合。以乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌、大腸桿菌和沙門氏菌屬特異性基因為靶基因構建標準質粒。PCR擴增引物及退火溫度見表1。

采用3步法定量檢測腸道菌群數量的q PCR，其中，大腸桿菌和沙門氏菌反應程序為：95℃預變性30 s；40個循環，95℃變性5 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s。乳酸桿菌和梭菌反應程序為：95℃預變性30 s；40個循環，95℃變性5 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s。雙歧桿菌反應程序為：95℃預變性30 s；40個循環，95℃變性5 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。反應體系為：SYBR Premix Ex Taq II 10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，模板2μL，加去離子水補足至20μL。每次RT-PCR擴增反應結束后，通過用熔解曲線（65～95℃）來檢測擴增產物的單一性。

1.5 數據處理

試驗數據用SPSS 19.0軟件進行統計分析，利用ANOVA、LSD進行差異顯著性檢驗和Duncan多重比較，試驗結果以平均值±標準差（Mean±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞生產性能的影響

2.1.1 平均日增重 丁酸梭菌CB1及其復合菌制劑對肉雞平均日增重的影響結果見表2。由表2可知，在1～21 d，C2和D組平均日增重均極顯著高于A組（P<0.01），D組平均日增重最高（37.74 g/d）；與B組相比，C1、C2和D組平均日增重分別提高了4.76%、6.54%、14.33%。在22～42 d，B組平均日增重極顯著高于A、C1、C2和D組（P<0.01）。在1～42 d，與A組相比，B、C1、C2和D組的平均日增重分別提高了5.46%、0.37%、1.52%和4.10%，D組與B組平均日增重基本持平。上述結果顯示，丁酸梭菌CB1制劑及其復合菌制劑對肉雞1～21 d促生長效果優于抗生素組，22～42 d促生長效果低于抗生素組，從全程比較，復合菌制劑促生長效果與抗生素相當。

表2 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞平均日增重的影響（單位：g/d）

2.1.2 料肉比與死亡率 由圖1可知，C2、D組料肉比與死亡率均優于A組和B組，說明在肉雞日糧中添加丁酸梭菌CB1及其復合菌制劑可以提高飼料轉化率和肉雞存活率。

2.2 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道形態的影響

丁酸梭菌CB1及其復合菌制劑對肉雞腸道形態的影響結果見表3和表4。由表3、表4可知，21 d時，B、C1、C2和D組回腸VH/CD值比A組分別提高了1.0%、1.51%、7.79%和32.41%。B、C1、C2和D組盲腸VH/CD值比A組分別提高了11.54%、50.00%、65.38%和95.51%。?D組回腸、盲腸VH/CD值均極顯著高于C1、C2組。

42 d時，B、C1、C2和D組回腸VH/CD值比A組分別提高了18.34%、19.48%、22.92%和47.56%，D組VH/CD值與B、C1、C2組相比差異極顯著（P<0.01）。B、C1、C2和D組盲腸VH/CD值比A組分別提高了31.49%、54.70%、80.11%和95.58%，D組VH/CD值最高。上述結果表明，日糧中添加丁酸梭菌CB1及其復合菌制劑可提高肉雞回腸、盲腸絨毛高度，降低隱窩深度和顯著提高絨毛高度與隱窩深度比值，有效改善腸道形態結構。

2.3 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道菌群的影響

丁酸梭菌CB1制劑及其復合菌制劑對腸道菌群的影響結果見表5和表6。由表5、表6可知，在21 d時，回腸中乳酸桿菌數量C1、C2和D組極顯著高于A組和B組（P<0.01），B組乳酸桿菌數量最低；雙歧桿菌數量C1、C2和D組極顯著高于B組（P<0.01）；大腸桿菌數量各處理組均低于A組。盲腸中乳酸桿菌數量C2、D組極顯著高于A組和B組（P<0.01）；雙歧桿菌數量C1、C2和D組極顯著高于A組和B組（P<0.01），與B組相比，分別提高了8.25%、10.77和9.34%；大腸桿菌數量各處理組均低于A組；沙門氏菌數量C2和D組顯著低于A組（P<0.05）。添加丁酸梭菌CB1制劑提高了C1、C2和D組回腸、盲腸中梭菌數量。

在42 d時，C1、C2和D組回腸乳酸桿菌、雙歧桿菌數量極顯著高于B組（P<0.01）；大腸桿菌數量B、C1、C2和D組均極顯著低于A組（P<0.01）。盲腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌數量C1、C2和D均極顯著高于A組和B組（P<0.01），雙歧桿菌數量B組最少；沙門氏菌數量C1、C2和D組顯著低于B組（P<0.05）。上述結果顯示，在肉雞日糧中添加丁酸梭菌CB1及其復合菌制劑提高了回腸、盲腸乳酸桿菌和雙歧桿菌數量，降低了沙門氏菌的數量，高劑量組和復合菌組尤其顯著。

3 小結與討論

3.1 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞生產性能的影響

丁酸梭菌能夠促進機體對營養物質的消化吸收，提高肉雞生產性能。杜云平等［11］研究表明，日糧中添加丁酸梭菌可明顯改善肉雞日增重、飼料轉化率和經濟效益，日增重比對照組提高了4.61%，飼料轉化率提高9.26%，只均利潤提高0.97元。趙旭［12］研究報道，日糧中添加丁酸梭菌顯著提升了肉雞的平均日采食量和日增重（P<0.05）。丁酸梭菌還具有降低脂肪沉積的功能，其主要的代謝產物丁酸發揮重要作用，丁酸梭菌也改變了肉雞腸道中的菌群結構，從而促進肉雞的脂肪合成。

表5 丁酸梭菌CB1制劑對21 d肉雞腸道菌群數量的影響 ［單位：log（copies/g）］

表6 丁酸梭菌CB1對42 d肉雞腸道菌群數量的影響 ［單位：log（copies/g）］

本研究中，肉雞日糧中添加丁酸梭菌CB1及其復合菌制劑能夠改善肉雞生產性能，有效降低料肉比和死亡率。在1～21 d，丁酸梭菌CB1制劑添加組C1、C2和D組的平均體重顯著高于抗生素組（P<0.05或P<0.01），但22～42 d的平均體重極顯著低于抗生素組（P<0.01）。其原因可能是在生長前期，肉雞腸道菌群不完善，外源添加丁酸梭菌CB1及其復合菌制劑迅速促進了腸道菌群的建立及維持穩態，促進機體的生長，其作用優于抗生素。在21 d后，腸道菌群變化逐漸趨于穩定，丁酸梭菌CB1制劑對菌群豐度的影響作用趨低，而抗生素調整菌群豐度作用趨高，其作用優于丁酸梭菌CB1制劑。龔琪等［13］研究發現，雛雞盲腸菌群從7～14日齡為一個過渡期，從14～42日齡為相對穩定期，益生菌或抗生素的添加可以促進腸道菌群在過渡期更有效地完成過渡，在穩定期維持更穩定的狀態。經試驗全期分析，在肉雞日糧中添加丁酸梭菌CB1與枯草芽孢桿菌TL復合菌制劑（200 g/t），其促生長效果與金霉素組相當，能替代抗生素類藥物，起到抗病促生長的作用。

3.2 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道形態的影響

腸道是營養物質消化和吸收的主要部位，腸道功能與腸絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD）密切相關。VH/CD比值升高，說明腸道形態功能得以增強，消化吸收功能提高。劉來亭等［14］報道，添加0.6%、0.9%酪酸芽孢桿菌可顯著提高肉雞小腸絨毛高度（P<0.05）。日糧中添加不同劑量的丁酸梭菌，與對照組相比，顯著提高了肉雞14、21和42 d回腸絨毛高度，降低了隱窩深度（P<0.05）；肉仔雞飼喂益生菌飼料添加劑后，小腸黏膜皺襞增多，絨毛高度增高，小腸吸收面積增大［15］。本研究中，添加丁酸梭菌CB1制劑后能有效促進腸道形態的生長發育，顯著提高21、42 d肉雞盲腸和回腸VH/CD值，丁酸梭菌CB1復合菌制劑對腸道形態的改善優于抗生素。

3.3 丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道菌群的影響

動物腸道內復雜的微生物菌群對營養吸收和健康起著重要作用。丁酸梭菌為厭氧芽孢桿菌，能產生丁酸、乙酸和丙酸，促進雙歧桿菌、乳酸桿菌等腸道有益菌群增殖，抑制大腸桿菌、傷寒沙門氏菌等致病菌和腐敗菌的生長，促進腸道微生物菌群平衡，降低有害物質的產生。丁酸梭菌能夠促進有益微生物的生長而減少有害菌的增殖，具有調控腸道內微生物群落結構平衡、優化宿主腸道內微生態環境的功能［16，17］。

本研究中，日糧中添加丁酸梭菌CB1制劑對肉雞腸道回腸和盲腸雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖有顯著的促進作用。在21和42 d，丁酸梭菌CB1制劑添加組C1、C2和D組回腸和盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌數量極顯著增加（P<0.01），高于A組和抗生素B組，大腸桿菌、沙門氏菌數量有降低的趨勢。在試驗中，隨著日齡的增加，腸道內容物中有益菌逐漸增加，有害菌不斷減少，說明丁酸梭菌CB1制劑在促進有益菌繁殖和維持腸道菌群平衡方面具有優勢。