HPLC法同時測定養心草中五種成分的含量

張 艷，丁仿霞，張建永

（遵義醫科大學藥學院，貴州 遵義 593099）

養心草學名景天三七（Sedum aizoonL.），又名費菜、土三七、養心菜等，為薔薇目景天科的多年生草本植物，具有養心、平肝寧心、滋陰養血、活血止血之功效，在民間廣泛將其作藥食兩用的天然物用于降血脂、降血壓及相關心臟病的防治，也被稱為“救心草”或“救心菜”，含有多酚類、黃酮類、生物堿、多糖、齊墩果酸、谷甾酸、氨基酸及維生素等成分［1，2］，其中黃酮類成分是養心草的主要有效成分，研究表明養心草總黃酮有抗氧化、抑菌、調節血脂以及抑制肝癌細胞增殖的作用［3，4］。所以測定養心草中黃酮類成分的含量可以對養心草的質量進行初步控制，為養心草總黃酮的進一步研究提供質量保證。經文獻查閱，對養心草質量控制研究多是對其總黃酮或單一黃酮成分的含量測定［5-8］，未達到中草藥多成分質量控制的要求。此外，梁泰剛等［9］、嚴勁松［10］分別采用HPLC法測定了養心草中2～3種黃酮類成分，本研究在已有文獻的基礎上，進一步通過對提取方法、色譜條件的優化，擬建立能夠準確、靈敏、快速同時測定養心草中槲皮素、槲皮苷、蘆丁、楊梅苷、山奈酚5種化學成分含量的方法，對養心草的質量進行初步控制，為養心草藥食同源的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilient Technologies 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；HH-S6水浴鍋，濟南歐萊博科學儀器有限公司；KQ-300VDE雙頻數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE2000A旋轉蒸發儀，上海雅榮生化儀器廠。

1.1.2 藥材與試劑 養心草全草采自遵義市新洲鎮，經遵義醫科大學張建永副教授鑒定為景天三七，楊梅苷（PS001009）、槲皮苷（PS000433）、槲皮素（PS010462）、山柰酚（PS001201）、蘆?。≒S002032）對照品均購自成都普思生物科技有限公司，純度>98%；甲醇，色譜純，OCEA NPAK公司；磷酸，分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取楊梅苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚對照品適量，分別置10 mL容量瓶，甲醇溶解定容，制備得濃度依次為2.2、0.25、1.6、0.16、0.28 mg/mL的對照品儲備液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取養心草全草，粉碎，過四號篩，稱取本品粉末約1.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入25 mL 50%甲醇溶液，稱定重量，90℃加熱回流30 min，放冷，補足失重，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為樣品溶液。

1.2.3 色譜條件 采用Gemini-Nx3μ-C18110A Phe?nomenex（150 mm×3.0 mm，3μm）色譜柱，流動相：甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，35%A；20～34.5 min，35%～36%A；34.5～35 min，36%～37%A；35～42.5 min，37%A；42.5～43 min，37%～54%A；43～49.5 min，54%A；49.5～50 min，54%～90%A；50～58.5 min，90%A；58.5～59 min，90%～35%A；59～64 min，35%A），流速0.4 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫35℃；進樣量20μL。

2 結果與分析

2.1 含量測定的方法學驗證

2.1.1 色譜圖 在“1.2.3”項的色譜條件下分別進樣5種黃酮混合對照品儲備液和養心草提取液進行色譜分析，得到圖1。

2.1.2 線性與范圍 依次精密量取楊梅苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚對照品儲備液適量于10 mL容量瓶，50%甲醇溶解定容，得到濃度依次為550、400、125、8、14μg/mL的混合對照品溶液，再依次量取混合對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL至10 mL容量瓶，50%甲醇溶解定容，得到系列濃度的混合對照品溶液，以峰面積y對濃度x（μg/mL）做回歸曲線，回歸方程、回歸系數和范圍見表1。

2.1.3 精密度試驗 按“1.2.2”的方法制備供試品溶液，HPLC法連續進樣6次，5種成分色譜峰面積的RSD值 分 別 為0.19%、0.67%、0.63%、1.83%、1.97%，說明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗 按“1.2.2”的方法制備供試品溶液，在0、4、8、12、16、24 h分別進樣分析，5種成分峰面積的RSD值分別為1.05%、2.71%、2.14%、3.54%、4.01%，說明樣品溶液在24 h內穩定。

2.1.5 重復性試驗 按“1.2.2”的方法制備供試品溶液6份，HPLC法進樣分析，測定峰面積，計算含量，5種成分含量的RSD值分別為1.40%、1.50%、2.03%、2.15%、3.08%，說明方法的重復性良好。

2.1.6 加樣回收試驗 取已知含量的養心草約0.5 g，按低、中、高（每個梯度3份）分別加入適量對照品溶液，按“1.2.2”的方法制備供試品溶液，進樣分析，測定峰面積，計算加樣回收率，結果見表2。5種成分的平均加樣回收率為95.61%～107.38%，RSD為1.37%～4.60%，說明該方法準確度良好。

2.1.7 樣品含量測定 按“1.2.2”的方法制備供試品溶液6份，采用HPLC法進樣分析，測定峰面積，計算5種成分的含量，結果見表3。由表3可知，RSD均小于5%，表明該方法準確可靠。

表2 加樣回收試驗結果（n=3）

表3 含量測定結果

2.2 提取工藝優化

2.2.1 單因素試驗 以養心草中5種成分的總含量為考察指標，分別比較提取溶劑（30%、50%、70%、90%）、提取溫度（70、80、90、100℃）和提取時間（20、30、60、90、120 min）對5種成分含量的影響，結果見圖2。由圖2可知，5種成分的總提取率分別在提取溶劑為50%甲醇、提取溫度為90℃、提取時間為30 min時最高。

2.2.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，按L9（34）進行正交試驗，因素與水平表見表4，結果見表5。由表5可知，3因素對5種成分總量的影響程度為提取溶劑>提取溫度>提取時間，提取時間過長使苷類化合物的含量下降，結合單因素試驗來看，綜合考慮養心草中5種黃酮類化合物的最佳提取條件為A2B2C2，即提取溶劑為50%甲醇、提取溫度90℃、提取時間30 min。

表4 正交試驗因素與水平

表5 正交試驗結果

3 小結與討論

除試驗采取的加熱回流提取方法外，還對比考察了冷浸提取法和超聲提取法，通過試驗比較發現，加熱回流提取方法較超聲提取穩定，提取率較冷浸法高，所以選擇加熱回流為試驗的提取方法。

在流動相的選擇中，分別篩選了甲醇-0.2%乙酸水、甲醇-0.2%甲酸水、甲醇-0.2%磷酸二氫鉀水、甲醇-0.2%磷酸水等系統，通過峰形、分離度、理論塔板數等對比，最后選用甲醇-0.2%磷酸水溶液進行梯度洗脫；對色譜柱進行篩選ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Phenomenex Gemini-Nx3μ-C18110A（150mm×3.0 mm，3μm），最后選用Gemini-Nx3μ-C18110A（150 mm×3.0 mm，3μm），分離效果較好，流速小，節約試劑；篩選檢測波長254、256、360和370 nm，經試驗驗證，檢測波長為256 nm，各成分的含量及峰形較穩定。

本研究通過單因素試驗和正交試驗篩選出養心草中5種黃酮類成分（楊梅苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚）的最優提取工藝，建立了以HPLC法為檢測手段，同時測定5種成分含量的方法，方法準確可靠，為養心草的質量控制提供科學依據。