雷公藤多苷片中雷公藤甲素與體外肝毒性相關性研究△

王曼虹，王雪，顏玉靜，黃芝瑛，汪祺*，文海若*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006

雷公藤多苷片（TripterygiumGlycoside Tablets，TPT）由衛矛科雷公藤屬植物雷公藤去皮制備而成，具有較強的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等藥理作用[1]，對類風濕性關節炎、腎病綜合征、自身免疫肝炎和皮膚病等均具有良好的治療效果[2]。但自TPT應用于臨床以來，其不良反應和器官毒性時有報道[3-4]，以肝臟毒性報道最為多見。如李紅剛等[5]發現，683 例服用TPT 的病例中110 例出現肝損傷，發生率約為16%，具體臨床表現為肝臟壓痛感、皮膚和尿液黃染、血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶（AST）水平升高等。研究提示，其毒性作用機制可能與脂質過氧化、肝細胞過度凋亡、免疫損傷、肝藥酶活性改變、糖和脂肪代謝異常等因素有關[6]。

TPT 所含成分復雜，主要成分包括生物堿、雷公藤甲素（triptolide，TP）、雷公藤內酯甲（wilforlide A，WA）和雷公藤紅素等[7]。研究提示，TPT 中TP 活性最強，但因該成分同時具有較強的毒性作用[8-9]，《中華人民共和國藥典》2020年版中TPT將TP列為檢查項，規定其上限。前期采用國家藥品監督管理局局頒標準（WS3-B-3350-98-2011）[10]對10個企業171批雷公藤多苷片進行標準檢驗發現，市場上TPT 中TP 含量多寡各異，部分企業生產的TPT中甚至不含有TP。因此，TPT的毒性是否僅與TP有關成為亟待解決的問題。

本研究采用人源肝細胞系HepaRG 研究不同生產企業生產的TPT 的肝毒性差異，同時明確TPT 中主要成分TP與肝毒性的相關性，本研究結果將為完善TPT的質量標準、臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

VICTOR X5 型多功能酶標儀（PerkinElmer 公司）；BD FACSCalibur 型流式細胞儀（美國BD 公司）；H500FR 型臺式高速冷凍離心機（Kokusan 公司）；7180 型全自動生化分析儀（日立公司）；PB203-N 型電子天平（Mettler-Toledo 公司）；CKX31 型顯微鏡（Olympus 公司）；SI-T246 Vortex-Ge 型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；ND-2000 型分光光度計（Thermo Fisher Scientific 公司）；iBright 1500 型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；Quantstudio DX 型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）。

1.2 試藥

人源肝細胞系HepaRG 購自Thermo Fisher Scientific 公司，本研究所用細胞為第12～13 代。TP對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111567-201404，純度：99.8%）；TPT（涉及生產企業：A～G，此處以字母代表；H 為在G 企業產品中人為在66.67 mg·mL-1TPT 中添加TP 100 μg·mL-1，作為TP 毒性評價對照）；cell counting kit-8（cck-8，日本同仁化學研究所）；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司）；TRNzol 總RNA 提取試劑（天根生化科技有限公司）；PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix ExTaq?Ⅱ(Tli RNaseH Plus)、ROX plus、DL2000 DNA Marker（寶生物工程有限公司）；引物合成（北京Invitrogen公司）。

2 方法

2.1 細胞毒性考察

將處于對數生長期的HepaRG 細胞消化后，調整至5×104個/mL，在96 孔板中每孔接種約5000 個細胞，孵育18～24 h 后給藥。分設空白對照組（不含HepaRG 細胞）、溶媒對照組［0.5%二甲基亞砜（DMSO）］及不同濃度的給藥組［TP 及WA 濃度：5～320 nmol·L-1；TPT質量濃度：根據各TPT給藥后細胞存活率，取半數抑制濃度（IC50）為中間濃度，并上下各設1 個濃度組］，于37 ℃、5% CO2的條件下孵育24 h 后，每孔加入CCK-8 檢測試劑10 μL，37 ℃避光孵育2 h 后用酶標儀檢測各孔450 nm 波長處的吸光度值（A），按公式（1）計算細胞存活率。在進一步毒性研究中，不同受試物的給藥濃度以IC50為中間濃度（高濃度時細胞存活率約為20%，低濃度時則約為70%）。

2.2 HepaRG細胞凋亡率考察

將處于對數生長期的HepaRG細胞消化后接種于6孔板中，待細胞貼壁生長覆蓋皿底80%～90%時給藥。分設溶媒對照組（0.5%DMSO）及不同濃度的給藥組（詳見2.1項），于37 ℃、5%CO2的條件下孵育24 h 后，收集上清液，并用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化細胞，合并收集于離心管中離心［4 ℃，3000 r·min-1，離心10 min（離心半徑為13.5 cm）］。細胞經預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 遍后，每管加1×binding buffer 100 μL 重懸細胞，在避光條件下每管加Annexin V-FITC 10 μL 并孵育15 min。之后，每管加碘化丙啶（PI）5 μL，孵育5 min。孵育完成后每管加入1×Binding Buffer 400 μL稀釋，吹打混勻后轉移至流式管中，1 h內上機檢測。

2.3 HepaRG細胞生化指標測定

細胞培養和給藥與2.2 項下方法相同。給藥處理結束后，樣本經離心［4 ℃，3000 r·min-1，離心10 min（離心半徑為13.5 cm）］分離出上清液。使用全自動生化分析儀檢測上清液中AST、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和谷氨酰轉肽酶（GGT）的水平。

2.4 HepaRG細胞因子水平測定

細胞培養、給藥及消化收集與2.2 項下方法相同。用TRNzol 總RNA 提取試劑提取細胞樣本的總RNA，以NanoDrop?ND-2000 測定總RNA 的濃度和純度。使用含gDNA Eraser 的PrimeScript ?RT reagent Kit 進行cDNA 反轉錄后，經SYBR GreenⅠReal time PCR（內參為18S rRNA 基因），檢測細胞樣本中白細胞介素-6（IL-6）、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和γ-干擾素（IFN-γ）表達量的變化，引物序列設計見表1。

表1 實時定量PCR法細胞因子測定引物序列

2.5 統計學方法

細胞存活率、細胞凋亡率、生化指標水平、細胞因子水平等數據用（）表示。采用單因素方差分析對組間數據進行檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。數據圖與統計結果經GraphPad Prism 7軟件處理生成。

3 結果

前期采用國家藥品監督管理局局頒標準（WS3-B-3350-98-2011）對10個企業171批雷公藤多苷片進行標準檢驗，在此基礎上選取其中7家生產企業的TPT進行進一步研究。這7家生產企業TPT中，TP含量差異較大（表2～3）。以66.67 mg·mL-1TPT計，不同企業TPT中含有的TP質量濃度在0～77.78 μg·mL-1，其中企業G的產品中TP質量濃度為0 μg·mL-1[11]。

表2 不同生產企業TPT中TP含量（）μg/片

表2 不同生產企業TPT中TP含量（）μg/片

表3 不同生產企業每66.67 mg·mL-1 TPT中TP質量濃度（）

表3 不同生產企業每66.67 mg·mL-1 TPT中TP質量濃度（）

3.1 TP及TPT的細胞毒性

使用CCK-8 法測定HepaRG 細胞經不同濃度（5～320 nmol·L-1）TP 處理24 h 后的相對細胞存活率。結果發現，TP 的IC50約為15.14 nmol·L-1。以下研究重點考察不同生產企業TP含量與毒性差異之間的關聯。

實驗發現，所有企業的TPT 均可顯著降低HepaRG 細胞的存活率，且隨著TP 濃度增加，細胞存活率逐漸降低且存在濃度效應相關性，見圖1。

圖1 TP及不同企業TPT對HepaRG存活率的影響

H為G企業樣品添加100 μg·mL-1TP的對照組，前者IC50低于后者（表4），提示TP 的加入可明顯增加TPT制劑的細胞毒性。

表4 不同企業TPT對HepaRG細胞IC50 μg·mL-1

3.2 TP及TPT對HepaRG細胞凋亡率的影響

細胞凋亡是藥源性肝損傷的重要作用機制之一，前期研究提示，誘導細胞凋亡是TP 的藥效學及毒理作用機制之一[12]。本研究使用流式細胞計數法研究TP 對HepaRG 細胞凋亡率的影響，發現TP 濃度＞20 nmol·L-1（約為7.20 ng·mL-1）時可顯著升高HepaRG 細胞凋亡率（P＜0.001），且呈一定濃度效應相關性（圖2）。

圖2 TP對HepaRG細胞凋亡率的影響（,n=3）

7 家生產企業TPT 的測定結果發現，除D 企業TPT中的低質量濃度6.66 μg·mL-1（相應TP質量濃度為7.20 ng·mL-1，與TP 單獨給藥導致凋亡起始濃度一致）僅引起HepaRG 細胞凋亡率微弱上升外（D毒性最弱，TP 含量也最低），其他企業TPT 均自低濃度起即可引起HepaRG 的凋亡率顯著上升，且存在濃度效應相關性（P＜0.05，P＜0.001，圖3）。結合不同TPT 中TP 濃度對HepaRG 細胞凋亡率的影響，TP 含量與HepaRG 細胞凋亡率有一定關聯，其中H 為G 的TP 添加對照，添加TP 后凋亡率相比G略有升高。然而C 企業樣品導致凋亡的起始濃度中含有的TP 經折算約為10 nmol·L-1，低于TP 單獨給藥導致凋亡的起始濃度。此外，在不含TP 的情況下，G仍可導致HepaRG細胞的凋亡率顯著上升，提示TP并非TPT導致細胞凋亡的唯一決定因素。

圖3 不同生產企業TPT（A～H）對HepaRG細胞凋亡率的影響

3.3 TP及TPT對HepaRG細胞生化指標的影響

血清生化指標中，AST、ALP、LDH、GGT 及CK 升高均與肝毒性有關[13]。研究結果發現（圖4），TP 濃度＞20 nmol·L-1時可導致LDH 升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），質量濃度＞40 nmol·L-1時可引起AST、ALP 升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；TP 在40 nmol·L-1時還可引起CK 的顯著升高（P＜0.05），在80 nmol·L-1時 可引起GGT 的顯著升高（P＜0.01），提示TP在不同濃度可導致不同程度的肝細胞功能異常。

圖4 TP對HepaRG生化指標的影響（,n=3）

不同企業樣品的測定結果發現（圖5），來自B、E、F 和H 企業的TPT 均可不同程度引起AST、ALP、LDH、CK、GGT等指標的升高，升高程度為H＞E＞B＞F；A 和C 企業的TPT 可引起AST、ALP、LDH、CK 的升高；G 企業的TPT 僅可引起AST、LDH 的升高，而D 企業TPT 對各個指標差異均無統計學意義（D 中TP 濃度最低）；結合各TPT 的藥物濃度及TP 濃度，提示肝損傷的發生與TPT 中的TP濃度相關。實驗為考察TP 的毒性作用，對比G 及人為添加TP 的對照H 樣本，添加TP 可導致AST 和LDH進一步升高，提示TP是引起肝細胞損傷的重要因素；且TP 進一步升高ALP 及CK 水平[13]從而對膽汁淤積與細胞能量代謝產生影響，但除此以外，TPT 中其他成分也存在一定肝毒性風險。本研究結果提示，各企業的TPT 均有一定的肝損傷作用，且TP 含量與細胞毒性、細胞凋亡、ALP、CK、TNF-α和IFN-γ變化直接相關，AST、LDH、TNF-α和IFN-γ是檢測TP導致的肝細胞毒性的較為靈敏指標，且變化趨勢與文獻中體內研究報道大致相符[14-16]。

圖5 不同生產企業TPT對HepaRG細胞生化指標的影響（,n=3）

3.4 TP及TPT對HepaRG細胞因子水平的影響

細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質，具有調節固有免疫和適應性免疫、血細胞生成、細胞生長及損傷組織修復等多種功能[13]。結果發現IL-6 和TNF-α為對TP 毒性最為靈敏的指標。TP濃度＞20 nmol·L-1時可顯著降低IL-6和TNF-α的水平（P＜0.001），濃度為20～40 nmol·L-1時可顯著升高IL-10及IFN-γ的水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，見圖6）。TP 可影響多種細胞因子分泌水平，從而介導抗炎和免疫抑制作用，上述結果與文獻報道基本相符[17-18]。

圖6 TP對HepaRG細胞因子水平的影響（,n=3）

如圖7 所示，來自7 個企業的TPT 均可降低HepaRG 細胞TNF-α的水平，且呈一定劑量效應相關性；此外，部分企業的TPT（如A、B、C、E 和F）可升高IL-10水平。上述變化趨勢與TP的作用基本相符，提示TPT的抗炎與免疫抑制作用與TP含量有關。然而，部分企業的TPT（如A、B、D、G 和H）則誘導IL-6 的水平升高；部分企業的TPT（如A、B、C、E 和F）可顯著降低IFN-γ水平，但B、E、F 和H 企業的TPT 作用濃度較高時（細胞存活率低于50%）導致IFN-γ水平升高，提示其雖有一定的抗炎作用，但也有一定的肝損傷作用。上述變化與TP 單獨作用的結果不符，故推斷TPT 中其他成分，尤其是在其存在一定細胞毒性的濃度下，可能對TP的抗炎作用產生一定影響。

圖7 不同生產企業TPT對HepaRG細胞因子水平的影響（,n=3）

4 結論

TPT 是目前臨床廣泛使用的非甾體類免疫制劑[19]，其療效顯著，但臨床不良反應不容忽視。據報道，TPT 的不良反應發生率可達58.1%，主要表現為藥物性肝炎、肝功能異常等[20]。TPT 的不良反應極大地限制了其臨床應用。研究提示，TPT 所含有的二萜、三萜類化合物及苷類物質均有一定的毒性[7]。現行標準將TP 列為檢查項，控制其上限。然而，不同生產企業的TPT 中TP 質量濃度差異顯著（0～77.78 μg·mL-1）[11]。盡管TP 藥效顯著，其毒性作用也不容忽視[21-22]。故將TP 含量控制在合理范圍內是保障TPT 臨床有效性、安全性的重要基礎，本研究針對TP在TPT整體毒性中扮演的角色進行了有益的探索。

綜上，本研究以HepaRG 細胞為實驗模型，發現TP 含量與TPT 的肝細胞毒性存在正相關，當TP細胞給藥濃度低于20 nmol·L-1時，其細胞毒性不明顯，可作為其在藥物中含量限設定的參考。然而TP的含量并非TPT誘發肝細胞毒性的唯一決定性因素。如A 企業和C 企業的TPT 也表現出較高的細胞毒性且AST等肝損傷指標呈顯著性升高。然而兩者TP含量較低，其肝毒性與TP含量無必然關聯。因此，后續可針對TPT 中更多成分的肝損傷風險展開研究。本研究結果將為完善TPT 質量控制指標、臨床合理應用提供參考。