基于HPLC指紋圖譜的白芍及酒白芍比較分析△

楊艷玲，劉彩鳳，黃嘉怡，楊海菊，李花花，杜守穎，白潔

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

白芍始載于《神農本草經》，為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，性微寒，味微苦、酸，具有養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽等功效[1]?，F代研究表明，白芍所含的化學成分有單萜類、三萜類、黃酮類、鞣質、多糖等化合物[2]，具有抗炎、鎮痛、保肝、抗氧化等多種藥理作用[3-6]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版白芍項下收載了炒白芍、酒白芍2 種炮制品，炒白芍長于養血斂陰，酒白芍長于緩急止痛、緩和酸寒之性[7]。宋代《扁鵲心書》中首次出現白芍“酒炒”炮制[8]，一直沿用至今。與炒白芍相比，酒白芍的炮制工藝有更多的影響因素，如黃酒用量、浸潤時間等。《中國藥典》2020 年版規定，白芍酒炒時每100 kg 飲片的黃酒用量為10～20 kg，但并未規定具體的工藝參數，如溫度、時間等。酒白芍炮制工藝的常用評價指標為芍藥苷含量，但不同研究者篩選出的最佳炮制條件不完全相同[9-10]。酒炒會使芍藥苷含量降低，也會使其他成分如多糖、苯甲酸等的含量發生變化，從而影響白芍的藥效[11-12]。只以芍藥苷作為指標性成分往往過于單一，難以反映中藥整體成分群的變化。因此，對酒白芍整體質量進行評價，比較酒炒前后的變化，有利于酒白芍的質量控制及炮制工藝的研究。

指紋圖譜具有整體性、模糊性的特點，中藥成分復雜，采用指紋圖譜技術可以充分反映中藥中化學成分的整體狀況，適合中藥整體質量控制，同時結合指標性成分含量測定和出膏率，有利于從多指標角度比較生品與炮制品的區別[13-14]。白芍藥材主要為栽培品，主產于安徽亳州、四川中江、浙江磐安和山東菏澤[15-16]。為了比較白芍酒炒前后的變化，且考慮到白芍多以水煎液入藥，本實驗選擇安徽亳州、四川中江、浙江磐安3 個主產地的白芍樣品，建立了白芍及炮制得到的酒白芍水煎液的指紋圖譜，對其進行相似度評價。芍藥苷是白芍中的主要活性成分，所以同時選擇芍藥苷含量作為評價指標，結合炮制前后出膏率變化，對其進行系統的質量研究。

1 材料

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀（DAD檢測器、CM 7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技中國有限公司）；QE-200 型高速萬能粉碎機（浙江屹立工貿有限公司）；BSA 224S型電子分析天平、BT 125D型電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；JM-B10002型電子天平（余姚市及紀銘稱重校驗設備有限公司）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康達圣科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品芍藥苷（批號：110736-201842，純度：97.4%，中國食品藥品檢定研究院）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

白芍及酒白芍均由億帆醫藥股份有限公司提供，經北京中醫藥大學中藥學院劉春生教授鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根及炮制品，詳細信息見表1。

表1 白芍及酒白芍來源

2 方法與結果

2.1 酒白芍的制備

依據《中國藥典》2020 年版標準，取白芍樣品，加黃酒拌勻，悶透，置炒制容器內，用文火炒至規定的程度時，取出，放涼[1]。每100 kg白芍用黃酒15 kg，文火炒至微黃色。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對照品11.14 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成質量濃度為445.60 μg·mL-1的對照品母液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取白芍（或酒白芍）3.0 g 于500 mL 的圓底燒瓶中，加水200 mL，100 ℃加熱回流65 min，用2 層300 目尼龍紗布濾過后放冷，滴加去離子水調整體積至200 mL，取濾液10 mL 離心10 min（10 000 r·min-1，離心半徑為5.79 cm），過0.45 μm濾膜，即得。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱：InertSustainSwiftTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，3%A；5～25 min，3%～9%A；25～40 min，9%～11%A；40～55 min，11%～12%A；55～70 min，12%～18%A；70～90 min，18%～34%A；90～100 min，34%～47%A；100～115 min，47%～95%A）；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：15 μL。

2.4.2 指紋圖譜處理方法 將數據以cdf.的格式導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件，對前8 min 的色譜峰進行剪切，采用中位數法，時間窗寬度為0.1 min，進行全譜峰匹配，計算相似度。

2.4.3 精密度試驗 按照2.3 項下方法制備供試品溶液1 份（B15），按照2.4.1 項下色譜條件，連續進樣6 次進行測定，圖譜按照2.4.2 項下方法處理。結果顯示，白芍與酒白芍的相似度均為1.000，剔除芍藥苷色譜峰的影響后，白芍與酒白芍的相似度均為1.000。以芍藥苷為參照，各共有峰的相對保留時間RSD 均小于0.07%，相對峰面積RSD 均小于2.52%，說明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 按照2.3 項下方法制備供試品溶液6 份（B15），分別測定，圖譜按照2.4.2 項下方法處理。結果顯示，白芍相似度均大于0.999，酒白芍相似度均大于0.995，剔除芍藥苷色譜峰的影響后，白芍相似度均大于0.995，酒白芍相似度均大于0.964。以芍藥苷為參照，各共有峰的相對保留時間RSD 均小于0.06%，相對峰面積RSD 均小于3.78%，說明該方法重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗 按照2.3 項下方法制備供試品溶液1 份（B1），分別在0、2、4、8、12、24 h 測定，圖譜按照2.4.2 項下方法處理。結果顯示，白芍與酒白芍相似度均大于0.999，剔除芍藥苷色譜峰的影響后，白芍相似度均大于0.996，酒白芍相似度均大于0.999。以芍藥苷為參照，各共有峰的相對保留時間RSD 均小于0.06%，相對峰面積RSD均小于2.81%，說明樣品在24 h內保持穩定。2

.5 指紋圖譜相似度分析

2.5.1 指紋圖譜的采集和共有模式的建立 將15批白芍藥材及酒白芍的數據按照2.4.2 項下方法進行處理，系統根據多批次樣品色譜圖的共有模式生成對照圖譜R，經標定有8 個共有峰，結果見圖1～2，其中8 號色譜峰為芍藥苷。由于芍藥苷色譜峰峰面積過大，而其他峰峰面積均較小，為了避免芍藥苷貢獻率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導致分析結果的誤差，因此相似度評價中剔除了芍藥苷色譜峰的影響。為方便下文數據分析及表達，將芍藥苷色譜峰編號為8，其余峰按照從左至右順序進行編號。

圖1 白芍藥材HPLC指紋圖譜

圖2 酒白芍HPLC指紋圖譜

2.5.2 白芍和酒白芍相似度評價 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012版）軟件分別生成白芍藥材和酒白芍對照圖譜，比較各樣品與相應對照圖譜的相似度，結果見表2，各批次白芍藥材與其對照圖譜之間相似度為0.988～0.999，各批次酒白芍與其對照圖譜之間相似度為0.991～0.999。剔除芍藥苷色譜峰的影響后再次計算相似度，結果見表3。各批次白芍藥材與其對照圖譜之間相似度為0.915～0.995，各批次酒白芍與其對照圖譜之間相似度為0.951～0.998，相似度均大于0.9，說明整體上相似性良好。

表2 白芍及酒白芍指紋圖譜相似度

表3 白芍及酒白芍指紋圖譜相似度（剔除芍藥苷后）

2.5.3 白芍與酒白芍HPLC 指紋圖譜比較 通過指紋圖譜相似度軟件評價白芍和酒白芍，兩者之間色譜峰相似度較高，區別較小，對照圖譜比較相似度達0.999，見圖3，表明酒炒對于整個峰群影響較小。因為芍藥苷的出峰時間適中，峰面積較大且穩定，因此以芍藥苷為參照峰，計算相對峰面積，結果見表4。通過8個共有峰相對峰面積比較可知，炮制后6號峰較生品有所下降，7號峰基本不變，其余的峰相對峰面積均有不同程度的增加。

圖3 白芍及酒白芍HPLC對照圖譜比較

表4 白芍和酒白芍共有峰峰面積分析（,n=15）

表4 白芍和酒白芍共有峰峰面積分析（,n=15）

注：以白芍中芍藥苷峰面積為1計算。

2.6 指標性成分定量分析

取白芍和對應的酒白芍，按照《中國藥典》2020 年版一部[1]中白芍項下芍藥苷的含量測定方法制樣，并進行測定，計算炮制前后芍藥苷的含量變化，結果見表5。由表5可知，白芍中芍藥苷質量分數為2.20%～5.28%，平均質量分數為3.23%；酒白芍中芍藥苷質量分數為2.52%～3.21%，平均質量分數為2.94%。含量變化平均值為-0.29%，說明酒炒會影響芍藥苷的含量。

表5 白芍及酒白芍中芍藥苷質量分數及變化 %

2.7 水提液出膏率分析

按照2.3 項下方法分別制備白芍炮制前后的供試品溶液，置于已恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，60 ℃真空干燥箱中干燥3 d，取出冷卻后準確稱取質量，按照公式（1）和（2）分別計算出膏率和出膏率變化幅度，結果見表6。

由表6 可見，不同批次樣品之間出膏率差別較大，15批白芍藥材的平均出膏率為19.73%，整體出膏率為13.53%～24.50%，其中B13 出膏率最高，B15 出膏率最低；炮制后15 批酒白芍的平均出膏率為20.98%，整體出膏率為15.89%～26.82%，其中J8出膏率最高，J3出膏率最低。

表6 白芍及酒白芍出膏率及變化幅度 %

比較白芍炮制前后出膏率的變化可知，第1、11、13、14 批樣品炮制后出膏率下降，且第11、13批下降較明顯；其余批次均有不同程度的升高，其中第8、15 批樣品出膏率升高幅度較大。出膏率變化幅度為-18.57%～36.38%，剔除第1、11、13、14批的異常值后平均變化幅度為2.45%。

3 討論

3.1 流動相體系及檢測波長的選取

本實驗分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸的流動相體系，由出峰數、柱壓及指紋圖譜整體的分離度，最終選擇乙腈-0.1%磷酸水作為流動相；選擇210～300 nm 的波長對供試品溶液進行掃描，發現在230 nm 條件下，基線相對平穩，響應值高，峰數量較多，分離度較好，因此選取230 nm作為檢測波長。

3.2 白芍及酒白芍質量評價

本實驗通過建立白芍酒炒前后的HPLC 指紋圖譜，進行相似度評價，發現白芍與酒白芍之間相似度較高；含量測定結果表明，白芍酒炒前后指標性成分芍藥苷質量分數變化為-2.13%～0.49%，整體呈下降趨勢。白芍酒炒后出膏率整體呈上升趨勢，第1、11、13、14 批炮制后出膏率反而降低，原因可能為不同產地及批次白芍之間本身存在質量差異，以及藥材凈制過程中去細根、去皮操作不完全一致等。這也提示在白芍的生產加工過程中應注意規范化，以保證藥材質量。

3.3 白芍炮制前后的成分變化

從整體上分析，白芍炮制前后對芍藥苷含量影響較大，由指紋圖譜相對峰面積結果可知，峰1 炮制后相對峰面積有不同程度的升高，可能原因為酒潤、炒制過程中增加了該成分的溶出[17]；峰6炮制后相對峰面積有所下降，可能原因為炒制及煎煮過程中該成分受到破壞，及轉化為其他成分等[18]。白芍的主要成分為芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷等，本實驗結果中，白芍酒炒后芍藥苷的含量大部分降低，少數升高。芍藥苷的含量有很多影響因素，如炮制溫度、儲存方式等。劉亮鏡等[17]研究表明，白芍酒炒之后芍藥苷含量略有升高，原因可能為乙醇促進了芍藥苷的溶出。但大部分研究者發現，白芍酒炒會降低芍藥苷、苯甲酸的含量，增加芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷的含量[19-20]。芍藥苷在炮制過程中可能會轉化為芍藥內酯苷和苯甲酰芍藥苷，芍藥苷受熱不穩定，炒制過程中易被破壞；而苯甲酸是白芍中的有害成分，炮制后含量減少，因此篩選最佳炮制工藝，有利于提高白芍質量[21-22]。

本研究建立的方法穩定可行，可以系統地對白芍酒炒前后整體成分群的相似性和差異性進行比較，同時成分的變化也是炮制前后藥理作用研究的基礎，也可為其他藥材炮制的研究提供參考。