半夏白術天麻湯治療癲癇作用機制的網絡藥理學研究△

盧玲，胡躍強，李歡，廖現秋，何乾超，蔡倫，刁麗梅*

1.廣西中醫藥大學 研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學 第一附屬醫院，廣西 南寧 530023

癲癇是大腦生理結構或功能紊亂引起的一種嚴重的神經系統疾病，有超過半數的癲癇患者伴有1 種或多種并發癥[1]。精神疾病（如抑郁癥、焦慮癥、精神病、自閉癥）及軀體疾病（如1 型糖尿病、關節炎、消化道潰瘍、慢性阻塞性肺病）均與長期的癲癇發作有關[2]。然而，長期使用抗癲癇藥物不良反應較大，且約有50%的患者單獨使用1 種抗癲癇藥物不能很好地控制癲癇發作[3]。大量的實驗及臨床研究表明，中西醫結合治療癲癇效果優于單純使用化學藥治療[4]。中醫認為，癲癇與“風”“瘀”“痰”“火”等病理因素密切相關。半夏白術天麻湯具有化痰熄風、健脾祛濕之功用，臨床上可辨證用于治療“風”“痰”所致的癲癇證型[5-6]。實驗研究表明，半夏白術天麻湯可以通過干預微小RNA（miRNA）的表達，影響癲癇相關的生物學功能及信號通路，從而改善癲癇發作后的炎癥反應，發揮抗癲癇作用[7-8]。但是，半夏白術天麻湯中的活性成分治療癲癇的作用機制尚不明確。

近年來，以“多組分靶向網絡”為主要研究模式的中藥網絡藥理學日益興起，其主要通過預測中藥化合物的靶向分布和藥理作用揭示藥物-基因-疾病網絡關系，并詮釋中藥復方的配伍規律及作用機制[9-11]。本研究基于中藥復方多成分、多靶點、多途徑作用的理念，通過網絡藥理學技術，研究半夏白術天麻湯的主要作用成分、靶點及其生物學功能及信號通路，以揭示其治療癲癇的作用機制。

1 材料與方法

1.1 中藥復方活性成分的收集

分別在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、BATMANTCM 數據庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）及TCMID 數據庫（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）中，分別以“半夏”“白術”“天麻”“橘紅”“甘草”“茯苓”為關鍵詞，對半夏白術天麻湯中的每味中藥的化學成分進行檢索，剔除重復部分。對在TCMSP中能夠檢索到的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%[12]且類藥性（DL）≥0.18[13]為條件，篩選得到半夏白術天麻湯的活性成分。

1.2 藥物成分對應靶點的收集

根據獲得的半夏白術天麻湯的活性成分，分別在TCMSP及BATMAN-TCM 數據庫中獲得其成分對應的靶點蛋白。再將靶點蛋白導入到UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）獲取每個靶蛋白所對應的靶基因，即半夏白術天麻湯活性成分作用的靶點。

1.3 半夏白術天麻湯治療癲癇的潛在靶點獲取

通過OMIM 數據庫（https://omim.org/）和在線文本挖掘服務器GeneCards（https://www.genecards.org/），以“epilepsy”為關鍵詞檢索及去重后獲得癲癇相關靶點。基于在線軟件Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對半夏白術天麻湯成分作用的靶點及癲癇相關的靶點取交集，兩者共有的靶點即是半夏白術天麻湯治療癲癇的潛在靶點。

1.4 成分-靶點網絡的構建

將半夏白術天麻湯治療癲癇的潛在靶點及其對應的中藥活性成分整理成關系對文件，并將其導入Cytoscape 3.6.1 軟件進行可視化網絡的構建。獲得半夏白術天麻湯活性成分-癲癇靶點的關系網絡。在Cytoscape 3.6.1 軟件中計算出網絡中每個節點的度（degree）值。癲癇靶點的度值越大，表示作用于該靶點的中藥活性成分越多；半夏白術天麻湯活性成分的度值越大，則表示該活性成分可以作用的癲癇靶點越多。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建及拓撲結構分析

將半夏白術天麻湯治療癲癇的潛在靶點導入STRING 11.5（https://string-db.org/）數據庫中，設定最高置信度為0.9，獲取網絡信息；將網絡信息導入Cytoscape 3.6.1軟件，使用CytoNCA 插件計算介數中心性（betweenness，BC），并構建PPI核心子網絡，篩選出半夏白術天麻湯治療癲癇的核心靶點。

1.6 基因富集分析

在R 3.5.0 軟件中，基于clusterProfiler包[14]，對篩選得到的半夏白術天麻湯治療癲癇的潛在靶點進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。以P＜0.05 且Padjust＜0.05 為篩選條件，分別選取富集前20 位的GO條目及KEGG通路。

1.7 KEGG關系網絡的構建

將排名前20 位的KEGG 通路及癲癇相關靶點信息排列成關系對文件，導入Cytoscape 3.6.1 軟件中。計算出網絡中每個節點的度值，并且根據度值的大小調整節點的大小。

2 結果

2.1 半夏白術天麻湯活性成分及其靶點

對半夏白術天麻湯的每味中藥的成分進行篩選后，得到半夏活性成分13個、白術7個、茯苓15個、甘草92 個、橘紅9 個、天麻46 個。剔除重復或者無固定結構信息的成分后，得到半夏白術天麻湯的活性成分共130 個，部分活性成分的基本信息見表1。再 將130 種活性成分在TCMSP 及BATMAN-TCM 數據庫中檢索，獲得半夏白術天麻湯活性成分作用的靶點共446個。

表1 半夏白術天麻湯部分活性成分基本信息

2.2 半夏白術天麻湯治療癲癇的潛在靶點

通過OMIM 數據庫及GeneCards 數據庫總共收集得到癲癇相關的靶點4620 個。使用在線數據庫Venny 2.1 對癲癇相關的4620 個靶點及半夏白術天麻湯活性成分作用的446 個靶點取交集，共得到258 個半夏白術天麻湯治療癲癇的潛在靶點（圖1）。

圖1 半夏白術天麻湯治療癲癇的潛在靶點韋恩圖

2.3 成分-靶點網絡

將半夏白術天麻湯治療癲癇的258個潛在靶點與活性成分匹配成關系對文件，導入Cytoscape 3.6.1軟件構建得到半夏白術天麻湯活性成分-癲癇靶點關系網絡（圖2），并且計算網絡中每個節點的度值（表2）。結果表明，半夏白術天麻湯的多種活性成分可作用于同一個靶點；而同一個靶點也可匹配多種活性成分。進一步闡明，半夏白術天麻湯通過多靶點、多成分對癲癇共同起治療作用。

表2 半夏白術天麻湯治療癲癇的核心靶點（度值≥30）

圖2 半夏白術天麻湯活性成分-癲癇靶點關系網絡

2.4 PPI網絡的構建及拓撲結構分析

將半夏白術天麻湯治療癲癇的258 個潛在靶點導入STRING 11.5 數據庫中，通過計算BC，獲得PPI 核心子網絡（圖3）。結果表明，半夏白術天麻湯治療癲癇的258 個潛在靶點間均存在直接或間接的相互作用。此外，β2腎上腺素受體（ADRB2）、鈣調蛋白1（CALM1）、雌激素受體1（ESR1）、一氧化氮合酶2（NOS2）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）不僅與半夏白術天麻湯的活性成分聯系密切，而且共同存在于PPI 核心子網絡中；其可能是半夏白術天麻湯治療癲癇的核心靶點。

圖3 半夏白術天麻湯治療癲癇核心靶點的PPI核心子網絡

2.5 GO分析和KEGG分析

對半夏白術天麻湯治療癲癇的258 個潛在靶點進行基因富集分析，GO分析的結果表明，生物學過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）3 個部分都得到了顯著的富集。其中，包括類固醇代謝過程（steroid metabolic process）、對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、對類固醇激素的反應（response to steroid hormone）、對銨離子的反應（response to ammonium ion）等生物學過程；A 型γ-氨基丁酸受體復合物（GABA-A receptor complex）、γ-氨基丁酸受體復合物（GABA receptor complex）、氯通道復合物（chloride channel complex）、突觸膜（synaptic membrane）、GABA 能突觸（GABA-ergic synapse）等細胞成分；神經遞質受體的活動（neurotransmitter receptor activity）、GABA-A 受體活動（GABA-A receptor activity）、GABA 受體活 動（GABA receptor activity）、GABA 門控的氯離子通道活性（GABA-gated chloride ion channel activity）等分子功能（圖4）。

圖4 半夏白術天麻湯治療癲癇潛在靶點的GO分析

KEGG 通路富集分析的結果表明，篩選出的半夏白術天麻湯治療癲癇的潛在靶點可能通過參與神經活性配體-受體相互作用（neuroactive ligandreceptor interaction）、白細胞介素-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、內分泌的阻力（endocrine resistance）、催乳激素信號通路（prolactin signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等通路及途徑發揮作用（圖5）。

圖5 半夏白術天麻湯治療癲癇潛在靶點的KEGG通路富集

2.6 KEGG關系網絡

KEGG關系網絡（圖6）顯示，在半夏白術天麻湯治療癲癇的258個潛在靶點中，有144個靶點富集到了前20 條KEGG 通路上，其中包括ADRB2、CALM1、ESR1、NOS2、MAPK14 5個核心靶點。

圖6 半夏白術天麻湯治療癲癇潛在靶點-KEGG通路關系網絡

3 討論

半夏白術天麻湯出自《醫學心悟》，臨床上常用于治療癲癇、頭痛、高血壓及耳源性眩暈等[5]。研究發現，天麻的有效成分天麻素可明顯減少大鼠癲癇發作的頻率，改善腦電圖情況，對大腦具有保護作用[15]；甘草提取物中的甘草甜素和甘草黃酮具有神經保護作用，能夠減少癲癇后的神經損傷[16-17]；茯苓皮提取物及半夏提取物也具有抗癲癇的作用[18-19]。然而，半夏白術天麻湯發揮作用的活性成分及其作用機制尚不明確。網絡藥理學包括化學信息學、生物信息學、網絡生物學和藥理學，是一種能夠揭示中藥方劑生物活性成分和潛在機制的研究方法[20]。本研究基于網絡藥理學，對半夏白術天麻湯中的活性成分、作用靶點、靶點之間的相互作用關系、靶點的生物學功能及富集的通路進行綜合分析，探討半夏白術天麻湯治療癲癇的作用機制。

本研究結果表明，半夏白術天麻湯的活性成分中，能夠作用于較多癲癇相關靶點的活性成分主要有槲皮素、天麻素、γ-谷甾醇、山柰酚、羥基芐胺、柚皮素、甘草查耳酮A、山豆根堿、β-谷甾醇、黃芩素、對羥基甲醇等。在癲癇發生過程中，神經元和星形膠質細胞都發生了氧化應激。研究表明，以氧化應激為靶點的臨床藥物，可明顯減少癲癇患者的發作頻率[21]。槲皮素可能通過直接清除活性氧和調節抗氧化酶活性而發揮抗癲癇的作用[22]。天麻素可以明顯改善患者的氧化應激的水平，減少癲癇患者腦部氧化應激損傷[23]。山柰酚、槲皮素、黃芩素等黃酮類化合物可以與GABA-A 受體上的苯二氮卓類藥物位點相結合，保護大腦免受氧化應激的傷害，發揮抗癲癇作用[24]。同樣，炎癥反應在癲癇的發生發展中扮演著重要的角色[25]。柚皮素能夠通過平衡GABA-A 受體，降低丙二醛和TNF-α水平，升高谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過氧化氫水平，影響神經炎癥從而發揮抗癲癇的作用[26]。c-Jun N 末端激酶（JNK）與神經元細胞的凋亡密切相關，研究發現，甘草查耳酮A 能夠選擇性地抑制JNK1，從而降低癲癇的嚴重程度和神經元的損傷，減少細胞凋亡生物標志物和神經炎癥，發揮抗癲癇的作用[27]。

成分-靶點網絡及PPI網絡綜合分析的結果顯示，ADRB2、CALM1、ESR1、NOS2、MAPK14 這5 個靶點可能是半夏白術天麻湯治療癲癇的核心作用靶點。有證據表明，ADRB2激動劑能夠降低抗癲癇藥物的抗癲癇作用[28-29]。同樣，越來越多證據顯示，在癲癇患者嗅球組織中NOS2 表達上調[30]，且NOS2 可以調節氧化應激反應[31]。增強突觸刺激可以激活MAPK，最終導致癲癇的發作，而通過抑制MAPK通路可以減少癲癇所致的神經元損傷[32-33]。此外，癲癇發作顯著抑制了突觸的可塑性，且短期可塑性主要取決于突觸部位鈣水平的波動和穩態[34]，ESR1 的神經保護作用主要是通過對突觸的可塑性的影響[35]。

GO富集分析結果表明，半夏白術天麻湯治療癲癇靶點的功能主要體現在對類固醇激素反應、GABA-A 受體復合物、GABA 受體復合物、氯通道復合物、突觸膜、GABA 能突觸、神經遞質受體的活動、GABA-A 受體活動、GABA 受體活動、GABA 門控的氯離子通道活性、苯二氮卓受體活動等方面，與文獻記載一致[36-39]。KEGG 通路富集分析結果表明，半夏白術天麻湯治療癲癇的信號通路主要有神經活性配體-受體相互作用、IL-17 信號通路、5-羥色胺能突觸、內分泌的阻力、催乳激素信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。研究證實，神經受體活性、炎癥反應、免疫反應、膠質細胞激活、突觸傳遞、離子轉運、突觸可塑性和神經信號轉導均與癲癇的發生和發展密切相關[40]。促炎性信號通路IL-17信號通路和腫瘤壞死因子信號通路在誘導血腦屏障破壞和中樞神經系統自身炎癥過程中起著關鍵作用，參與了癲癇的“神經免疫性炎癥”過程[41]。5-羥色胺是神經元興奮性的有效調節因子，長期以來的研究認為，其可以控制癲癇的發作活動，且動物模型的證據表明，癲癇大鼠海馬組織中5-羥色胺的基礎水平和周轉率均低于正常大鼠，5-羥色胺能傳遞受到損害[42]。通過提高催乳素的水平可以抑制癲癇活動[43]。此外，部分癲癇患者可伴有內分泌系統的疾病，包括亞臨床甲狀腺功能減退、生長減慢、體質量異常、生殖和性功能障礙等[44]。綜上，半夏白術天麻湯活性成分作用的靶點的生物學功能及富集的信號通路，與文獻記載相吻合，進一步表明半夏白術天麻湯對癲癇的治療是多通路共同起作用的結果。

本研究所獲得的半夏白術天麻湯的活性成分中，有多個活性成分均有減少氧化應激、抗炎癥反應、減少神經元損傷、干預細胞凋亡、調節GABA 等功能。而活性成分作用的核心靶點及潛在靶點的生物學功能、富集的信號通路均與氧化應激過程、炎癥過程、突觸傳遞及GABA 能等神經遞質的調節密切相關，表明半夏白術天麻湯治療癲癇是通過多成分、多靶點、多途徑共同起作用的。

本研究通過網絡藥理學技術，初步揭示了半夏白術天麻湯治療癲癇的作用機制，為拓寬半夏白術天麻湯在治療神經系統疾病方面的應用提供了參考，但實驗結果還需要進一步的驗證。