山茱萸不同炮制品中8個化學成分的含量測定

肖紅，王東春，舒琴，周莉娟

內江市第二人民醫院 藥劑科，四川 內江 641000

山茱萸具有澀精固脫、補益肝腎的功效，現代藥理研究表明，山茱萸具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、保護神經、抗阿爾茨海默病等作用，主產于我國陜西、甘肅、浙江、山西、江西、安徽、山東等省，為我國傳統名貴中藥材[1]。山萸肉是山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉[2]，具有補益肝腎、收澀固脫的功效。《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版記載，山茱萸的炮制品有山萸肉和酒萸肉，《河南省中藥飲片炮制規范》2005 年版記載，山茱萸炮制品有山萸肉、酒蒸山萸肉、蒸山萸肉和醋蒸山萸肉。文獻資料顯示，醋蒸山萸肉可增強收斂澀精作用，清蒸山萸肉、酒蒸山萸肉可增強補肝腎作用[3]。山萸肉生品活性成分主要包括環烯醚萜苷類（莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷等）、有機酸（沒食子酸）及其酯類、五環三萜類（齊墩果酸、熊果酸等）、鞣質、多糖等[4]，其中，莫諾苷、馬錢苷具有抗神經退行性病變、抗血栓、抑制黑色素、抗糖尿病等作用[5]；5-羥甲基糠醛具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病及抗組織缺氧等藥理活性[6]；獐牙菜苷有保護肝細胞、促進細胞修復的作用；山茱萸新苷Ⅰ具有抗炎、保肝利膽、抗氧化、調節心血管系統[7]及防治骨質疏松[8]等功效；齊墩果酸與熊果酸為同分異構體，均具有降血糖、調血脂[9]、保肺、保肝、抗腫瘤[10]的作用；沒食子酸具有抗氧化、抗癌、降血糖、調血脂等作用[11]。現有文獻多集中在山萸肉和酒萸肉的含量測定，尚未有關于同時測定山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉中有效成分含量的文獻研究[12-15]。鑒于此，本研究利用高效液相色譜法（HPLC）對山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉中熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、山茱萸新苷Ⅰ8 個成分含量進行比較，為提高山茱萸炮制品的質量提供參考。

1 材料

U-3000 型高效液相色譜儀（UV2489PDA 檢測器，美國賽默飛世爾公司）；YF-111型高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；ABS-135S型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；KQ-3200B型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

3 批山茱萸藥材均購于禹州藥材市場，標示產地為河南西峽，經內江市第二人民醫院許瓊主任中藥師鑒定為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉分別按照《中國藥典》2020 年版四部通則0213 炮制。對照品山茱萸新苷Ⅰ（批號：PS1022-0025）、獐牙菜苷（批號：PU0045-0025）均購于成都普思生物科技股份有限公司，純度均大于98%；對照品沒食子酸（批號：110831-201605，純度：90.8%）、熊果酸（批號：110742-201622，純度：94.7%）、莫諾苷（批號：111998-201602，純度：96.3%）、5-羥甲基糠醛（批號：111626-201711，純 度：99.4%）、齊墩果酸（批號：110709-201607，純度：91.7%）、馬錢苷（批號：111640-201707，純度：99.2%）購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Stamsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，10%A；5～10 min，10%～27%A；10～30 min，27%～40%A；30～50 min，40%～60%A；50～65 min，60%A；65～70 min，60%～10%A）；檢測波長[15]：218 nm（0～10 min，沒食子酸）、284 nm（10～15 min，5-羥甲基糠醛）、240 nm（15～50 min，莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷和山茱萸新苷Ⅰ）、360 nm（50～70 min，齊墩果酸和熊果酸）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10 μL。在上述色譜條件下，供試品中各色譜峰與相鄰色譜峰分離良好，色譜峰對稱因子均在0.95～1.05，理論板數按莫諾苷計不低于5000。色譜圖見圖1。

圖1 山茱萸供試品溶液和混合對照品溶液高效液相色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取8 個待測成分對照品適量，精密稱定，置同一100 mL 量瓶中，用甲醇超聲溶解并定容，搖勻，制成熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、山茱萸新苷Ⅰ質量濃度分別為0.287、0.080、0.659、0.051、1.247、2.691、0.002、0.429 mg·mL-1的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別取山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉樣品各約20 g，粉碎過篩（二號篩），混勻，分別精密稱取細粉1.0 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇30 mL，閉塞，稱量，超聲提取（功率：250 W，頻率：40 kHz）60 min，放冷至室溫，稱質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過（0.45 μm），即得[16]。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 取2.2.1 項下混合對照品溶液，分別量取0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置10 mL 量瓶中，用甲醇定容并稀釋制成系列質量濃度混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積。以對照物質量濃度為橫坐標（X），8 成分色譜峰峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，計算回歸方程和相關系數。數據見表1。

表1 山茱萸8個成分的回歸方程及線性范圍

2.3.2 精密度試驗 取2.2.2 項下山萸肉供試品溶液，按2.1項下色譜條件，連續進樣6針，記錄色譜圖峰面積，計算峰面積RSD。結果熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和山茱萸新苷Ⅰ峰面積RSD 分別為1.65%、1.22%、1.37%、0.64%、1.05%、1.27%、0.86%、1.41%，均符合要求，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取2.2.2 項下山萸肉供試品溶液，分別于0、3、6、9、12 h 后，按2.1 項下色譜條件測定，記錄色譜圖并計算8 個成分峰面積RSD。結果熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和山茱萸新苷Ⅰ峰面積RSD 分別為0.88%、1.06%、1.34%、1.52%、1.35%、1.74%、1.64%、1.09%。表明供試品溶液在12 h內穩定性較好。

2.3.4 重復性試驗 精密取同一批山萸肉供試品粉末適量，按2.2.2 項下方法平行制備6 份，按2.1 項下色譜條件分析，記錄色譜圖并計算8 個化學成分的峰面積RSD 及含量。結果沒食子酸、齊墩果酸、熊果酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷和山茱萸新苷Ⅰ含量RSD 分別為1.32%、1.68%、1.12%、0.96%、1.37%、1.11%、1.06%、0.89%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的山萸肉供試品，精密稱取0.5 g，平行9份，分別置100 mL具塞錐形瓶中，分成低、中、高3組，分別精密加入含沒食子酸0.097 mg·mL-1、齊墩果酸0.797 mg·mL-1、熊果酸0.347 mg·mL-1、5-羥甲基糠醛0.002 mg·mL-1、莫諾苷3.252 mg·mL-1、獐牙菜苷0.062 mg·mL-1、馬錢苷1.507 mg·mL-1、山茱萸新苷Ⅰ0.518 mg·mL-1的混合對照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2項下方法制備，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖峰面積，計算8 個化學成分的加樣回收率及相應RSD，結果見表2。

表2 山茱萸8個化學成分加樣回收率試驗

續表2

2.4 樣品含量測定

取3 批山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉供試品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，每批依法平行測定3 次，記錄色譜圖峰面積，計算各成分的含量，結果見表3。

表3 山茱萸樣品含量測定結果（n=3） mg·g-1

3 討論

3.1 待測成分的選擇

現代研究表明，山萸肉生品活性成分主要包括環烯醚萜苷類、有機酸及其酯類、五環三萜類、鞣質、多糖等，其中以莫諾苷、馬錢苷為代表的環烯醚萜苷類及以齊墩果酸和熊果酸為主的五環三萜類化合物是山茱萸最具有生物活性的成分。5-羥甲基糠醛是一種重要的呋喃基化合物，是由單糖經美拉德反應或焦糖化反應脫水生成，性質不穩定，其體內代謝物在一定劑量下有明顯的刺激性、致敏性、腎毒性、致癌性等潛在毒性[17]，同時研究發現，5-羥甲基糠醛是山萸肉炮制后保肝護肝作用增強的原因之一[18]。因此，選擇熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和山茱萸新苷Ⅰ作為山萸肉不同炮制品的待測成分。

3.2 供試品溶液提取方法選擇

本研究考察超聲和熱回流2 種提取方法，60%、70%、80%、90%、100%不同比例的甲醇和乙腈提取溶劑，30、40、60 min 不同超聲提取時間對實驗的影響。結果熱回流方法提取雜質峰較多，莫諾苷色譜峰后有一相鄰色譜峰與其分離效果差，超聲提取法提取完全、操作簡便、干擾峰少；80%甲醇較其他比例提取溶劑，8 個化學成分提取率高；超聲提取時間達到40 min 時，8 個化學成分均可完全溶出，延長提取時間并不能提高提取效率，故選擇80%甲醇超聲提取（250 W，40 kHz）40 min作為山茱萸不同炮制品供試品溶液的制備方法。

3.3 色譜條件選擇

參考相關文獻，本研究考察了不同梯度的乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水流動相體系對分析結果的影響[19]。結果表明，梯度洗脫較等度洗脫色譜柱壓力更平穩，8 個化學成分的分離效果更好，有機相乙腈的洗脫能力優于甲醇，0.1%磷酸溶液較水作為流動相無機相色譜峰峰形更好，有效改善了色譜峰拖尾問題。故確定采用乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫作為流動相系統。采用二極管子陣列檢測器，在190～400 nm 對對照品和供試品溶液進行掃描，結果顯示，莫諾苷等環烯醚萜苷類成分在240 nm處有最大吸收，沒食子酸在218 nm處有最大吸收，5-羥甲基糠醛最大吸收波長為284 nm，齊墩果酸和熊果酸最大吸收波長為360 nm，故本研究采用波長切換法［218 nm（0～10 min，沒食子酸）、284 nm（10～15 min，5-羥甲基糠醛）、240 nm（15～50 min，莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷和山茱萸新苷Ⅰ）、360 nm（50～70 min，齊墩果酸和熊果酸）］研究山茱萸不同炮制品中8個化學成分的含量。

3.4 含量測定結果分析

山萸肉炮制品有效成分的含量變化與中醫理論的“生熟異用”觀點有較大關聯。由表3 可知，酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉相對于山萸肉，莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢苷和山茱萸新苷Ⅰ的含量均降低；而沒食子酸、5-羥甲基糠醛、齊墩果酸和熊果酸的含量經酒制和醋制后均增加。相關研究發現，山萸肉經酒蒸炮制后齊墩果烷系皂苷可水解為齊墩果酸和熊果酸，因此抗病毒、抗炎和抗氧化應激作用增強；莫諾苷等環烯醚萜苷類成分經炮制后降解；山萸肉經蒸制后美拉德反應或焦糖化反應加強，5-羥甲基糠醛含量增加，以酒萸肉增加最為明顯；山萸肉炮制品較山萸肉生品中沒食子酸的含量增加，但炮制品間含量差異較小[20]。

4 結論

本研究建立了HPLC 同時測定山茱萸不同炮制品（山萸肉、酒萸肉、醋萸肉和蒸萸肉）中熊果酸、沒食子酸、齊墩果酸、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、山茱萸新苷Ⅰ8 個活性成分的含量測定方法，經方法學驗證，該方法準確、專屬、耐用性高、操作簡單、重復性好，可為山茱萸及其炮制品的臨床研究提供參考。