熱敏灸對新生小鼠缺氧缺血性腦損傷抗凋亡作用的研究

歐陽昕，宋渺渺，肖愛嬌，陳明人

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

新生兒缺氧缺血性腦損傷所導(dǎo)致的缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)發(fā)病率較高[1]，每1 000個活產(chǎn)兒當(dāng)中就有2～4個遭受這種病的影響[2]，這也是產(chǎn)生新生兒死亡和殘疾的主要原因[3]。HIE生理病理變化過程十分復(fù)雜，涉及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等多個方面[4]。因此，研究其相關(guān)機(jī)制和探索高效的治療手段具有重要意義。

中醫(yī)藥治療HIE日益受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注。研究表明，針灸被廣泛應(yīng)用于該病的治療，并取得了一定的療效[5]。本課題組最新的實驗研究也發(fā)現(xiàn)，艾灸具有減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的作用[6]。隨著灸療技術(shù)的創(chuàng)新，熱敏灸應(yīng)運而生，且廣泛推廣，艾灸的臨床療效隨之大幅度提升，其中治療缺血性中風(fēng)取得了卓著的療效[7]。此外，本課題組近年來多項研究也發(fā)現(xiàn)熱敏灸能明顯減輕成年大鼠腦缺血再灌注損傷[8-10]。這些研究成果為本次實驗選用熱敏灸來治療新生小鼠HIE提供了豐厚的前期積累。我們發(fā)現(xiàn)，熱敏灸應(yīng)用在HIE新生小鼠中的研究甚少，而且其作用機(jī)制的研究也少有人涉足。因此，本課題以HIE新生小鼠為研究對象，采用熱敏灸為干預(yù)手段，觀察小鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)、caspase-9表達(dá)和caspase-3水平的變化，探討熱敏灸治療HIE的可能機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級健康成年ICR小鼠共8只，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心，生產(chǎn)許可證號：SYXK(贛)2017-0004，飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室。按雌鼠∶雄鼠=3∶1比例合籠，母鼠孕期為21 d，待其自然分娩，小鼠出生當(dāng)日計為P0，使用P7 (出生后第7天)新生小鼠52只(不限雌雄)。

1.2 主要試劑與儀器

TTC試劑(Sigma)，S7165凋亡原位檢測試劑盒(Millipore)，#9505兔抗小鼠caspase-9(Cell Signaling Technology)和A11011山羊抗兔IgG(Invitrogen)，caspase-3放免試劑盒 (北京華英生物技術(shù)研究所)。CM1950冰凍切片機(jī)，Leica2000熒光顯微鏡，圖像分析軟件(Leica)，XH-6020全自動放免計數(shù)儀(西安核儀器廠)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

所有新生鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(13只)、模型組(13只)和艾灸組(26只)。假手術(shù)組僅行頸部手術(shù)，不做缺血、缺氧；模型組閉合右側(cè)頸總動脈造成缺血，并置于缺氧箱進(jìn)行缺氧；艾灸組同模型組，并于缺氧后行艾灸治療，同時于艾灸前、后測量尾溫，將艾灸組進(jìn)一步分為非熱敏灸組(艾灸尾溫差≤1.5 ℃)和熱敏灸組(艾灸尾溫差>1.5 ℃)。

2.2 缺氧缺血性腦損傷模型的建立

在RICE-VANNUCCI[11]和LEVINE[12]方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合本課題的實際情況進(jìn)行了必要的改進(jìn)，制備了HIE新生小鼠模型，具體操作方法請參見文獻(xiàn)[13-15]。

2.3 操作方法

艾灸組施以艾灸療法：用直徑4 mm×150 mm的熱敏灸艾條距大椎穴20 mm處懸灸，該穴定位參照文獻(xiàn)[16]。首次治療于造模后2 h進(jìn)行，35 min/次，此后1次/d，連續(xù)治療3 d。

2.4 腦組織形態(tài)學(xué)觀察

于術(shù)后3 d，各組分別取3只鼠采用HE染色觀察腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。給予小鼠異氟烷吸入麻醉后迅速取腦，相機(jī)拍照，隨后行石蠟切片(厚度5 μm)、HE染色、封片，最后在鏡下(×400)觀察。HE染色具體操作方法參見文獻(xiàn)[6]。

2.5 腦組織細(xì)胞凋亡檢測

于術(shù)后3 d，各組分別取3只鼠采用TUNEL染色觀察腦組織細(xì)胞凋亡。首先給予小鼠異氟烷吸入麻醉后迅速取腦，相機(jī)拍照，隨后行冰凍切片(厚度35 μm)，進(jìn)行TUNEL染色，詳細(xì)步驟參照文獻(xiàn)[13-15]。染色后使用顯微鏡觀察拍照，最后用Image J軟件計數(shù)每個200倍視野下的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

2.6 腦組織caspase-9陽性細(xì)胞檢測

標(biāo)本數(shù)量和取材同2.5。使用時，每個標(biāo)本取2片，進(jìn)行caspase-9免疫熒光染色，具體操作方法請參見文獻(xiàn)[13]，其中一抗為兔抗小鼠 caspase-9(1∶400)，二抗為山羊抗兔IgG(1∶500)。熒光顯微鏡拍照后用Image J 軟件計數(shù)每個400倍視野下的caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)。

2.7 腦組織caspase-3含量檢測

于術(shù)后3 d，各組分別取7只鼠進(jìn)行腦組織caspase-3含量檢測。給予小鼠異氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取腦，分離患側(cè)大腦半球，勻漿后采用放射免疫分析法測定caspase-3含量，同時測定腦組織蛋白質(zhì)水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 熱敏灸對HIE小鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

3.1.1 各組小鼠腦組織大體觀察

假手術(shù)組腦組織紅潤，腦溝及腦回清晰；模型組右半球見大面積梗死灶，腦組織液化、壞死，腦溝、腦回消失；非熱敏灸組右半球可見小面積梗死灶，腦組織液化、壞死，腦溝變淺、腦回變寬；熱敏灸組右半球可見更小面積梗死灶，腦組織液化、壞死現(xiàn)象不明顯，腦溝及腦回較清晰(見圖1)。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.非熱敏灸組；D.熱敏灸組,虛線框為梗死灶。圖1 各組小鼠腦大體形態(tài)

3.1.2 各組小鼠腦組織切片HE染色結(jié)果

從圖2可以看出，假手術(shù)組右側(cè)腦組織排列致密，腦細(xì)胞無明顯脫落；模型組患側(cè)腦組織排列疏松，腦細(xì)胞脫落甚多；非熱敏灸組患側(cè)腦組織排列較疏松，腦細(xì)胞脫落較少；熱敏灸組患側(cè)腦組織排列較致密，腦細(xì)胞脫落最少。

3.2 熱敏灸對HIE小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響

見圖3。TUNEL陽性細(xì)胞呈紅色，對4組結(jié)果對比觀察后，可以看出假手術(shù)組陽性細(xì)胞很少，模型組多，而非熱敏灸組和熱敏灸組較少。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.非熱敏灸組；D.熱敏灸組。圖2 小鼠腦組織切片HE染色圖片(×400)

圖3 各組小鼠腦組織TUNEL染色(比例尺=50 μm)

通過對4組腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)模型組明顯多于假手術(shù)組(P<0.05)；非熱敏灸組和熱敏灸組均少于模型組(P<0.05)，熱敏灸組更少，見表1。

表1 小鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較

3.3 熱敏灸對HIE小鼠腦組織caspase-9表達(dá)的影響

Caspase-9陽性細(xì)胞呈紅色，對4組免疫熒光檢測結(jié)果比較可知，假手術(shù)組中caspase-9表達(dá)很少，模型組表達(dá)很多，而非熱敏灸組和熱敏灸組表達(dá)較少,見圖4。

圖4 小鼠腦組織caspase-9表達(dá)免疫熒光檢測結(jié)果(比例尺=50 μm)

通過對4組小鼠腦組織caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分析，可知模型組多于假手術(shù)組(P<0.05)；非熱敏灸組和熱敏灸組均少于模型組(P<0.05)；尤以后者減少更為明顯(P<0.05)，見表2。

表2 小鼠腦組織caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)比較

3.4 熱敏灸對HIE小鼠腦組織caspase-3含量的影響

從表3可以看到，模型組腦組織caspase-3含量高于假手術(shù)組；非熱敏灸組和熱敏灸組caspase-3含量明顯均低于模型組(P<0.05)。

表3 各組小鼠腦組織caspase-3含量比較

4 討論

目前，低溫治療被證實是HIE唯一的神經(jīng)保護(hù)干預(yù)方法，并成為治療HIE的標(biāo)準(zhǔn)做法[17]。然而，單靠低溫治療顯然不足以成功治療所有的HIE患者[3]。有數(shù)據(jù)顯示，受益的患者不到1/6[18]。另外，有臨床研究[4]指出盡管早期開始低溫治療可為腦缺氧缺血后的患兒提供神經(jīng)保護(hù)，但急性損傷后單獨應(yīng)用低溫治療，并不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的嚴(yán)重?fù)p傷，也不能有效地改善HIE的預(yù)后，甚至?xí)蚱鋷淼牟涣挤磻?yīng)嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量和對治療的依從性。因此，探索一種新的、起輔助作用的神經(jīng)保護(hù)措施勢在必行。

由于中醫(yī)藥治療HIE具有顯著的優(yōu)勢，不僅可以有效減輕HIE所致的神經(jīng)后遺癥，而且可以減少治療過程中所出現(xiàn)的毒副作用，引起國內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注，并開展了長期的研究。課題組前期動物實驗觀察到艾灸對缺氧缺血性腦損傷新生小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。作為中醫(yī)艾灸療法傳承與創(chuàng)新的熱敏灸，既具有艾灸的特性，又展示了獨特優(yōu)勢。其治療手段是通過艾條燃燒的熱量刺激熱敏腧穴，從而激發(fā)經(jīng)氣感傳，氣至病所，達(dá)到醫(yī)治的效果。臨床證實其療效明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的艾灸療法[19-20]。因此，本課題組首次嘗試選用熱敏灸對HIE新生小鼠進(jìn)行治療。

值得注意的是，臨床實踐證明，在艾灸距離和艾灸強(qiáng)度一定的情況下，熱敏灸的療效與艾灸時間有關(guān)。傳統(tǒng)的艾灸時間為15 min，通常不能激發(fā)熱敏化腧穴產(chǎn)生熱敏灸感，當(dāng)艾灸時間為30～60 min時，艾灸熱敏化腧穴時可產(chǎn)生熱敏灸感。因此，熱敏灸時間一般需要30 min以上。本課題組以往的工作發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷大鼠艾灸大椎穴35 min的療效優(yōu)于15 min[21]。需要補(bǔ)充的是，由于鼠類不能描述熱敏灸感，無法根據(jù)熱敏灸感判斷“大椎”穴是否為熱敏化穴位，因而依據(jù)熱敏灸的傳熱這一特性，觀察艾灸“大椎”穴35 min后尾溫是否升高，將艾灸35 min組進(jìn)一步分為非熱敏灸組和熱敏灸組。結(jié)果觀察到，同樣是艾灸35 min，出現(xiàn)尾溫升高的療效優(yōu)于尾溫未升高的[22]，即熱敏灸的療效優(yōu)于非熱敏灸。本次實驗在操作過程中注意把握兩個要點，即艾灸時間長短問題和熱敏灸判別問題，并嚴(yán)格按照實驗步驟進(jìn)行，結(jié)果觀察到非熱敏灸和熱敏灸組小鼠腦梗死面積均縮小、腦損傷減輕，尤以熱敏灸組更為明顯，表明熱敏灸具有顯著減輕缺氧缺血性腦損傷的作用，然而其作用機(jī)制尚不十分清楚。

本研究通過對腦組織TUNEL染色，觀察實施熱敏灸干預(yù)后腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)的變化。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，HIE組小鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加；與HIE組相比，非熱敏灸組與熱敏灸組小鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)均減少，尤以熱敏灸組減少更為明顯。這說明了兩個問題：一是缺氧缺血性腦損傷確實發(fā)生了細(xì)胞凋亡，這與文獻(xiàn)[13-15]報道的結(jié)果基本一致；二是熱敏灸具有抗凋亡的作用。

為了進(jìn)一步明確熱敏灸抑制細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制，本次實驗著重觀察了細(xì)胞凋亡啟動組中的caspase-9和細(xì)胞凋亡執(zhí)行組中的caspase-3。結(jié)果表明，非熱敏灸與熱敏灸均可降低小鼠腦組織中caspase-9表達(dá)和caspase-3水平，尤以熱敏灸降低更為突出。這一實驗結(jié)果說明了熱敏灸可能通過降低腦組織caspase-9表達(dá)和caspase-3水平，從而起到抗凋亡的作用。

綜上所述，本實驗研究初步證實，熱敏灸可通過降低caspase-9表達(dá)和caspase-3水平，減少腦組織細(xì)胞凋亡，達(dá)到減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的作用。這一實驗結(jié)果為臨床應(yīng)用熱敏灸治療新生兒HIE提供了實驗依據(jù)及理論支持，有可能作為臨床新生兒HIE治療的一種有效的輔助手段。