外源性脂多糖對山麻鴨雛鴨生長、血清激素、肝、脾及肌纖維發育的影響

張續勐，黎頌超，蔡穎宇，王金輝，江丹莉*

(1. 仲愷農業工程學院動物科技學院， 廣東 廣州 510225；2. 廣東省水禽健康養殖重點實驗室， 廣東 廣州 510225)

我國是水禽養殖大國，廣東省又是我國水禽養殖大省，憑借珠江三角洲的地理優勢，近年來鴨養殖量也呈快速增長趨勢[1]。產肉量是衡量鴨生產性能的重要指標，目前鴨的養殖模式大多采取半開放養殖模式，水體中極易滋生大腸桿菌和沙門菌[2]。在水體溫度較高或養殖密度較高的養殖場內容易發生大腸桿菌和沙門菌的大量增殖[3]，這也就使得水體和鴨血液中細菌內毒素脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)濃度也隨之上升。

LPS是一種熱穩定毒素，革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，LPS很難從細胞壁脫落，當細菌死亡時它會通過溶解、破壞細胞來脫落，并通過作用于動物細胞等而發揮其毒性。LPS具有特殊組成結構和生物活性部位，是常見誘導急性感染和炎癥反應的主要因素。進入機體后可以誘導機體產生大量炎癥因子，繼而引發機體一系列免疫反應，在免疫應激狀態下，動物機體免疫機能將受到影響，合成代謝降低，分解代謝增強，免疫力下降，甚至嚴重時會導致機體損傷。這種反應對鴨的生長性能有著不利的影響[4]。

有不少研究者曾就LPS對家禽的影響進行探究。馬邯生等[4]研究顯示，用100、500、1 000 μg/kg體重LPS分別在16、18、20日齡注射肉仔雞，顯著降低了肉仔雞的采食量和日增重。江丹莉等[5]研究顯示，對29日齡的山麻鴨每7 d注射1 mg LPS后，飼料回報率降低，生長相關激素水平降低。而本團隊前期對3～9日齡馬崗鵝分2組隔日注射200 和100 μg LPS，2組鵝在試驗前期采食量均顯著降低。LPS處理顯著降低了雛鵝生長速度，高劑量組中尤為顯著[6]。

此前，學者們主要關注點在于LPS對水禽的致炎性影響，鮮有對外源性LPS處理下雛鴨肌纖維發育的變化進行探究。而雛鴨所處的時期，是肌肉生長過程中的重要階段。因此，本試驗將通過定期腹腔皮下注射法，探索不同濃度LPS對山麻鴨早期生長、血清激素、肝、脾及肌纖維發育的影響，為揭示環境內毒素對山麻鴨早期生長發育的影響提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

7日齡健康山麻鴨由仲愷農業工程學院鐘村農場提供。

1.2 試驗設計

供試雛鴨已進行常規免疫。挑選24只體重相近(110±10)g的健康雌性山麻鴨，隨機平均分為4組(高濃度LPS組，高濃度對照組，低濃度LPS組，低濃度對照組)進行籠養。每日進行基礎飼糧喂養。自7日齡起，高濃度LPS組每隔2 d注射含有500 μg/kg LPS(血清型 O55:B5，Sigma公司)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)緩釋劑0.5 mL，高濃度對照組每隔2 d注射PVP 緩釋劑0.5 mL(由于第1次注射雛鴨反應較大，因此高濃度對照和高濃度組第1次注射間隔為4 d，其后為2 d)，低濃度LPS組每天注射含有200 μg/kg LPS的生理鹽水0.5 mL，低濃度對照組每天注射0.5 mL生理鹽水，注射方法采用腹腔皮下注射，注射劑量參考團隊前期在馬崗鵝雛鵝試驗中的濃度[6]，并根據注射時期、頻率和物種的不同進行了調整。試驗期間記錄每組山麻鴨的采食量和每只體重。由于注射頻率不同，為了減少雛鴨應激，所有試驗組體重測量的頻率按照高濃度組注射頻率進行。出生后的早期山麻鴨主要進行肌纖維肥大的過程，因此為了關注外源性LPS對山麻鴨肌纖維肥大過程的影響，于22日齡時進行采樣。對每只山麻鴨使用電子體重秤測量雛鴨體重，對雛鴨進行翅下靜脈采血，每只采集血液2 mL，離心后取約0.5～1 mL血清備用。每只試驗用雛鴨通過頸動脈放血法進行屠宰后，取相同部位的約1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm體積的腿肌和肝臟，以及完整的脾臟放入4%多聚甲醛溶液內備用，另外取相同體積的腿肌于凍存管中，放入液氮備用。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 內毒素含量的測定

采用鱟試劑法測量血清中內毒素含量。所有檢測步驟均按EC80545S試劑盒說明書規范操作。試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司。

1.3.2 激素含量的測定

采用ELISA 方法檢測血清中白介素6(IL-6)(XY-ELA0201)和生長激素(GH)(XY-ELA1911)含量。所有檢測步驟均按試劑盒說明書規范操作。試劑盒購自上海心語生物科技有限公司。

1.3.3 HE染色

HE染色主要進行如下步驟：4%多聚甲醛放置24～48 h進行組織固定；將肌肉放入包埋盒中脫水，70%乙醇(2 h)，80%乙醇(2 h)，95%乙醇(30 min)，無水乙醇(2.5 h)，50%無水乙醇+50%透明劑(30 min)，透明劑(2.5 h)，50%透明劑+50%石蠟(30 min)，石蠟(5 h)；將脫水后的組織放入鋼包埋盒中，用包埋機加入融化的石蠟，并在制冷平臺上凝固成蠟塊；將蠟塊固定在石蠟切片機上，用4 μm的厚度切片；將漂浮在37 ℃水面上的切片用載玻片撈到玻片正中位置，隨后放在50 ℃烘片機上烘干；將有石蠟切片的載玻片放入透明劑中10 min脫蠟；將載玻片在100%、95%、85%、70%、50%的乙醇、PBS以及純水中各浸泡2 min，并不時震蕩；將載玻片放入蘇木素中1～5 min，純水沖洗1 min，加入活化劑30 s，純水沖洗1 min，伊紅染色30 s～2 min，自來水沖洗1 min；玻片自然風干后，滴20 μL中性樹脂于載玻片標本中心，用鑷子蓋上載玻片。用正置熒光顯微鏡 (ZEISS, ImagerZ1)進行觀察拍攝并采集圖片。

1.3.4 肌纖維密度和橫截面積檢測

利用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)統計HE染色腿肌橫切面圖片。每張切片隨機挑選至少3個400倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野。保證每張照片的背景光一致。每張片子隨機挑選5個肌纖維，測量肌纖維的直徑(mm)，并求出平均值。統計每個視野中的纖維數和測量肌纖維的總橫截面積(mm2)，求出單位面積內肌纖維數量(個/mm2)。

1.3.5 實時熒光定量PCR

對腿肌分化期特異表達的基因肌細胞生成素(Myog)和肌球蛋白重鏈1(Myh1)進行鑒定。采用TRIzol法提取組織總RNA，并用cDNA反轉錄試劑盒將 RNA 反轉錄成cDNA。 鴨Myog的PCR上游引物序列為5′-CCCGAGCACTGCCCCGGGCAAT-3′，下游引物序列為5′- CGCTCCTGCTGGTTGAGGCTGCTG-3′；Myh1的PCR上游引物序列為 5′- CTCCTCACGCTTTGGTAAAT-3′，下游引物序列為 5′-GCTCTGGCTTCTTGTTGGAC-3′。本試驗采用GAPDH作為內參基因，上游引物序列為5′-TCTGTCGTGGACCTGACCTGC-3′，下游引物序列為5′-GCCAGCACCCGCATCAAA-3′。在LightCycler480 Ⅱ上進行熒光定量PCR，反應程序為：預變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 30 s，40個循環。

1.4 數據統計與分析

以每只雛鴨個體作為重復進行數據統計，數據分析使用SPSS 20軟件，Student’st計算組間差異，統計分析采用雙側檢驗，數據以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 外源性LPS對雛鴨采食量的影響

由圖1可見，低濃度注射外源性LPS降低了雛鴨7～9、15～16和20日齡的采食量；高濃度LPS組，雛鴨采食量在每次注射后第1天均有下降，但一般能在第2天有較大恢復，注射高濃度外源性LPS降低了雛鴨7、10～11以及13～19日齡的采食量。

圖1 不同濃度外源性LPS對山麻鴨采食量的影響

2.2 外源性LPS對雛鴨體重的影響

由圖2可見，低濃度LPS組對雛鴨體重的影響較小，與對照組沒有差異(P>0.05)，而高濃度LPS組從11日齡開始，除了第18日齡外，體重均顯著低于對照組(P<0.05)。

與同濃度對照組比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同

2.3 外源性LPS對山麻鴨血清生化指標的影響

由圖3A可知，低濃度LPS組和高濃度LPS組血液中的內毒素含量都略高于相應的對照組，但沒有達到顯著性差異(P>0.05)。GH含量低濃度對照組略高于低濃度LPS組，但沒有達到顯著性差異(P>0.05)，而高濃度組中LPS組和對照組差異較小(圖3B)。血清中IL-6在低濃度對照組含量略高于其他3組，但沒有達到顯著性差異(P>0.05，圖3C)。

圖3 不同濃度LPS處理對山麻鴨血清生化指標的影響

2.4 外源性LPS對山麻鴨肝臟、脾臟的影響

從22日齡取樣的肝臟、脾臟HE染色結果中可以發現，低、高濃度LPS組與對照組相比，肝細胞均排列緊密，大小基本一致，肝組織結構完整，未發現明顯病理變化，但高、低濃度LPS組均有數量不等的空泡樣變，特別是高濃度LPS組空泡較多(圖4)。

箭頭指示空泡狀變化；標尺=20 μm

對照組中山麻鴨脾臟組織結構排列規律，白髓中毛細血管和內皮細胞結構緊密，紅髓中的淋巴細胞較少，淋巴鞘被淋巴細胞圍繞。在低濃度LPS注射后，組織結構出現相對疏松的現象，白髓中血管和內皮細胞連接開始疏松，紅髓中的紅細胞發生了溶血，紅色顆粒增加，淋巴鞘旁的淋巴細胞開始導出遷移，這些現象在高濃度LPS組中更加明顯(圖5)。

Wp.白髓；Rp.紅髓；L.淋巴細胞。箭頭指示髓中淋巴細胞遷移和紅細胞溶血；標尺=20 μm

2.5 外源性LPS對山麻鴨腿肌肌纖維的影響

由圖6、圖7可知，高濃度LPS組肌纖維直徑極顯著低于高濃度對照組(P<0.01)，肌纖維密度沒有顯著差異(P>0.05)；低濃度LPS組肌纖維直徑和密度均與低濃度對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖6 不同濃度LPS處理后腿肌HE染色比較(標尺=20 μm)

圖7 不同濃度LPS對山麻鴨腿肌肌纖維密度(A)和直徑(B)的影響

2.6 外源性LPS對山麻鴨腿肌Myh1和Myog基因表達的影響

低、高濃度LPS組Myog的表達量均略低于相應對照組，但均未達到顯著性差異(P>0.05，圖8A)。高濃度LPS組Myh1的表達量顯著低于相應對照組(P<0.05)，低濃度LPS組Myh1的表達量略低于相應對照組，但未達到顯著差異(P>0.05，圖8B)。

圖8 不同濃度LPS對山麻鴨腿肌Myog(A)和Myh1(B)基因表達的影響

3 討論

7～22日齡是鴨肌肉發育最為關鍵的時期之一，這個時期肌纖維發育程度對鴨成年后的產肉量、生長速度等生長和經濟性狀產生重要影響。在本研究中，每天注射溶于生理鹽水的200 μg/kg LPS對山麻鴨的體重、肝臟、脾臟和肌纖維生長發育均無太大的影響。前人的研究結果顯示，在對肉仔雞用100、500、1 000 μg/kg體重LPS分別在16、18、20日齡進行注射，只有500、1 000 μg/kg體重LPS會引起機體免疫功能顯著下降，而低濃度的影響不明顯[7]。這說明禽類在試驗采樣相近的時期，對于較低濃度的LPS具有一定的耐受性，與本試驗結果相符。

在每隔2 d注射溶于緩釋劑中的500 μg/kg LPS后，鴨的生長發育較對照組變得緩慢，采食量明顯下降，體重顯著低于對照組，肝臟、脾臟發生輕微病變，并且腿肌肌纖維直徑顯著降低，肌肉分化標志基因Myh1表達顯著下調。說明高濃度外源性LPS可能通過影響雛鴨的采食量，減少雛鴨的營養攝入，抑制了肌纖維肥大的過程，從而導致體重降低。在小鼠成肌細胞模型中，在培養基中添加100 ng/mL LPS可能會通過升高IL-1和IL-6來影響成肌細胞的增殖和分化過程[8-9]。而LPS對山麻鴨肌纖維肥大過程的抑制是直接還是間接的作用，其具體的調控機制如何，還需要在山麻鴨的細胞試驗中進一步驗證。與本研究結果類似，團隊前期研究結果表明注射高濃度LPS會使鵝的早期采食量下降，肉鵝的胸肌率、腿肌率均顯著低于正常鵝群，說明了LPS能使得鵝的生長發育和屠宰性能下降[6]。LPS降低了山麻鴨的生長性能和免疫功能，對胸腺、肝臟、脾臟有一定的損傷[4]，這與我們對雛鴨的試驗結果類似。

在血清生化指標中高濃度或低濃度LPS處理組均使得雛鴨血清內毒素升高，但未到顯著水平，且內毒素在血清中含量不高，GH在組間差異不明顯，這可能是由于采樣時雛鴨日齡較大，代謝速度較快導致。IL-6受到的影響較小，與LPS處理組引起較小的肝臟、脾臟病理變化相符合。有研究表明，LPS會使肉鴨的肝臟、脾臟相對重量降低，并對心臟、肺、腎重量，肌胃和腺胃指數，以及腸道形態等指標產生顯著影響[10-11]。提示在本文研究的LPS注射濃度下，生長性能的變化可能不是通過GH分泌和應激反應造成的，而是通過消化、免疫系統等綜合因素對雛鴨的采食量、體重和肌肉發育所產生的直接或間接的影響。以上結果還需在后期研究中增加采樣點，通過對血清生化指標進行動態檢測來進一步證實。

Myog在肌肉起始分化時表達，并決定下游促進肌肉分化的基因表達，而Myh1則是肌纖維重要組成成分肌球蛋白重鏈的基因[12]。在本研究中，外源性LPS注射并沒有引起Myog基因的顯著變化，可能是因為Myog在肌肉分化起始表達[13]，發揮作用的時間早于我們的采樣時間。而在本試驗的采樣時期22日齡，Myh1基因在高濃度LPS注射后表達量顯著低于對照組，與腿肌HE染色結果中高濃度LPS處理組腿肌肌纖維直徑顯著低于對照組的表型相符。

在本研究的結果中，高濃度對照組的肌纖維密度明顯低于包括低濃度LPS組在內的其他幾組，而肌纖維直徑則明顯高于其他幾組。造成上述情況的原因，主要還是由于試驗設計上的考慮不周。由于實驗室同一規格的籠子數量不夠，因此在將雛鴨分組后，高濃度LPS組和相應對照組所用的籠子(70 cm×70 cm×40 cm，約12.24只/m2)規格要大于低濃度LPS組和相應對照組所用的籠子(60 cm×60 cm×40 cm， 約16.67只/m2)，因此高濃度LPS組與對照組、低濃度LPS組與對照組的飼養密度不同。凡文磊等[14]對15～40日齡肉鴨進行試驗，設置3個飼養密度(12、13、14只/m2)，結果發現隨著飼養密度增加，肉鴨個體出欄體重降低，飼養密度為13只/m2時總盈利最高。該密度與本研究中高濃度LPS組和對照組所使用的密度接近。由于肌肉重量占體重的比例較高，因此該密度下雛鴨的肌肉發育也很有可能好于其他密度組，從而具有較大的肌纖維直徑。綜上所述，本研究中組間的肌纖維發育差異主要是受到了飼養密度的影響，密度適中的雛鴨運動量比高密度的多，活動環境也好于高密度組，這可能是肌纖維發育較好的原因，而在同樣大小籠子(高濃度LPS組與對照組，低濃度LPS組與對照組)之間的比較結果中肌纖維發育的差異主要是受到了LPS的影響。由于飼養密度對于雛鴨肌纖維直徑和密度影響的研究還沒有報道，因此該結論還需進一步的試驗結果確證。

肌纖維發育直接決定了動物的產肉量，探索出一個適合山麻鴨生長發育良好的養殖環境，對提升山麻鴨養殖效率和產肉量有重大的意義。基于本研究和團隊前期在鵝胚中的研究發現，死胎中LPS濃度顯著高于活胚[15]，并且外源性LPS會顯著降低胚胎的孵化率[16]，提示LPS在胚胎期對禽類生長發育影響更大。而胚胎期也是肌肉發育最為關鍵的時期，禽類的肌纖維數目在出生前就已經決定，出生后的早期發育階段主要是肌纖維肥大過程[17]，這兩個過程直接決定了出生后產肉量[18]。因此，后期我們將進一步提前LPS處理時期至更早日齡甚至胚胎期，并增加更多的LPS處理濃度梯度，探索合適的飼養密度，增加試驗研究個體數量和采樣時間點，完善本研究的結果。

本研究通過探究不同濃度外源性LPS對山麻鴨早期生長、血清激素、肝、脾及肌纖維發育的影響，發現每隔2 d注射溶于緩釋劑中的500 μg/kg LPS會顯著降低山麻鴨雛鴨的體重和腿肌肌纖維直徑，而每天注射溶于生理鹽水的200 μg/kg LPS則對雛鴨體重和腿肌肌纖維發育幾乎沒有影響，此外，高濃度外源性的LPS會導致鴨的采食量下降，體重降低，對肝臟、脾臟有一定的損傷。研究結果為揭示環境內毒素對山麻鴨早期生長發育的影響提供了理論依據，為今后改善飼養環境，提升山麻鴨飼養效率提供了借鑒。