沙拉沙星、二氟沙星直接競爭化學發光酶聯免疫檢測方法的建立

李思，蔣蔚，盧春慧，程婷婷,，孫衛東，王權*

(1. 中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241； 2. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

氟喹諾酮類藥物已廣泛運用于人[1-2]與動物[3-4]疾病的治療當中，其中鹽酸二氟沙星、鹽酸沙拉沙星為獸類專用藥[5]。二氟沙星可通過脫甲基作用生成其活性代謝產物沙拉沙星，從而起到抗菌效果[6]。沙拉沙星是由美國雅培公司在1995年上市，并獲得FDA批準的第一個可用于食用動物的氟喹諾酮類藥物[7]。臨床上以鹽酸沙拉沙星的形式用藥，因其抗菌譜廣、藥效良好，所以被廣泛用于畜禽及水產類的細菌感染防治[8-9]。此外，鹽酸沙拉沙星價格低廉，是畜禽養殖戶的用藥首選，又由于不規范用藥或濫用的現象時有發生，易導致畜禽體內細菌耐藥性增強[10]，通過食物鏈對消費者的神經系統、葡萄糖代謝、皮膚等造成潛在的危害[11]。我國農業部已明文規定了二氟沙星、沙拉沙星在雞肉當中的最大殘留量分別為300 μg/kg、10 μg/kg[12]，美國已經全面禁止了氟喹諾酮類藥物在養殖領域的使用[13]。國內外用于沙拉沙星殘留檢測的方法主要包括：免疫分析方法[14]、高效液相色譜法(HPCL)[15]、液相色譜-質譜聯用法(LC/MS)[16-17]、超高效液相色譜法(UPCL)[18]等，其中后3種方法需要復雜且耗時長的樣品前處理，而且檢測儀器昂貴，不適用于市場上大量樣品的快速檢測。免疫分析方法當中主要包括酶聯免疫分析方法(ELSIA)[19]、膠體金免疫層析法(GICA)[20]、熒光免疫分析法(IFA)[21]、化學發光酶聯免疫法(chemiluminescence enzyme-linked immunoassay，CLEIA)[22]，具有快速、高特異性、高靈敏度等特點，可滿足市場上大批量快速檢測的需求。本研究中建立的直接競爭化學發光酶聯免疫分析方法(dc-CLEIA)，是將化學發光與酶聯免疫分析方法結合在一起，利用酶標記抗體，待免疫反應結束后，以酶催化化學發光底物，根據其化學發光強度進行定性及定量分析。此方法不僅可以縮短檢測時長，而且還能提高檢測靈敏度。

1 材料與方法

1.1 主要材料

沙拉沙星單克隆抗體(SAR-Ab)及包被抗原(SAR-1-OVA)，均由本實驗室制備；鹽酸沙拉沙星，購自上海源葉生物科技有限公司；二氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星等氟喹諾酮類藥物，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)，購自上海滿雪生物科技有限公司；高碘酸鈉(NaIO4)、四氫硼酸鈉(NaBH4)，購自國藥集團化學試劑有限公司；化學發光底物A液、B液，均購自湖州英創生物科技有限公司；超高性能發光檢測儀(BioTek?)。

1.2 酶標沙拉沙星抗體(McAb-HRP)的合成與鑒定

1.2.1 McAb-HRP的制備

根據文獻[23]的方法，采用改良過碘酸鈉法合成SAR-Ab辣根過氧化物酶標記物(McAb-HRP)。稱取6 mg HRP溶解于1 mL去離子水中，再加入300 μL NaIO4溶液(0.1 mol/L)，混勻，室溫下避光反應20 min。將反應后的混合液使用醋酸鈉溶液(1 mmol/L，pH=4.4)透析過夜，透析后的HRP溶液用碳酸鹽緩沖液(CBS,0.2 mol/L，pH=9.5)調節pH至 9.5 作為A液。取6 mg SAR-Ab溶于CBS(0.01 mol/L，pH=9.5)中作為B液，將A液與B液混合，室溫避光攪拌反應2 h。 加入80 μL NaBH4溶液(4 mol/L)，混勻，室溫避光反應1.5 h。再將反應產物以PBS(0.01 mol/L，pH=7.4)溶液于4 ℃透析 3 d，最后，與等體積甘油混合保存于-20 ℃。

1.2.2 McAb-HRP的鑒定

在220～440 nm范圍內進行對SAR-Ab、HRP、McAb-HRP的PBS溶液進行紫外光譜掃描鑒定，對比三者之間的最大吸收峰的位移及其吸收曲線變化，鑒定McAb-HRP是否偶聯成功。同時采用直接ELISA鑒定偶聯物McAb-HRP的效價，采用棋盤法，向酶標板中縱向包被SAR-1-OVA及OVA，橫向加入不同稀釋度的酶標抗體McAb-HRP，經ELISA常規操作，測得其效價。

1.3 dc-CLEIA檢測方法的建立

1.3.1 包被原濃度與酶標抗體稀釋比工作濃度確定

首先采用棋盤法，縱向包被不同濃度的包被原(SAR-1-OVA)，橫向包被不同稀釋度的酶標抗體(McAb-HRP)，根據RLU值，初步選擇數值在1×106左右的包被原濃度以及酶標抗體稀釋度作為初步工作濃度。采用二因子交叉試驗，在初步的工作濃度上下分別選擇3個不同的包被抗原及酶標抗體濃度，使沙拉沙星標準品終濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 ng/mL，對不同濃度的沙拉沙星標準溶液作dc-CLEIA，繪制各包被原及酶標抗體工作濃度下的抑制標準曲線，計算其靈敏度IC50(即50%抑制率時對應的沙拉沙星標準品濃度)的值，根據IC50的值選擇最佳工作濃度并建立標曲。

1.3.2 檢測步驟

用CBS(pH=9.6，0.05 mol/L)將包被原SAR-1-OVA稀釋到所需濃度，加入化學發光板中100 μL/孔，4 ℃孵育過夜，1×PBST洗板3遍，間隔5 min。5%脫脂乳200 μL/孔，37 ℃ 孵育 2 h，1×PBST洗板3遍，間隔5 min。洗板后加入50 μL稀釋好的標準品(或樣品)和50 μL McAb-HRP，置于37 ℃ 孵育1.5 h，1×PBST洗板3遍，間隔5 min。加入100 μL/孔的化學發光的底物液(A液∶ B液=1∶1)，5 min內，用超高性能發光檢測儀檢測，讀取化學發光值(RLU值)。

1.4 建立標準曲線

根據最佳工作條件結果，以沙拉沙星標準品濃度的對數值為橫坐標，以結合率B/B0作為縱坐標(B表示某一濃度沙拉沙星標準品抑制時對應的RLU值，B0表示空白樣品對應的RLU值)，建立沙拉沙星直接競爭化學發光標準曲線。

1.5 精密度試驗

用不同濃度的鹽酸沙拉沙星標準品進行競爭抑制時，以McAb-HRP與包被原SAR-1-OVA結合率的批內誤差和批間誤差來評價此方法的精密度。在同一次試驗中，每個標準品濃度做5組重復，以其批內變異系數表示其批內精密度；在不同的時間連續做5次，以其批間變異系數表示其批間精密度。

1.6 特異性試驗

取13種氟喹諾酮類藥物以及4種其他抗生素作為競爭抑制物，進行dc-CLEIA。擬出各藥物的抑制曲線，并計算出其半數抑制量(IC50)。最后，按公式得出各競爭抑制藥物與SAR-Ab的交叉反應率。

交叉反應率=(沙拉沙星標準品的IC50/其他競爭抑制藥物的IC50)×100%。

1.7 最低檢出限(LOD)試驗

1.8 樣品前處理

將雞胸肉用組織勻漿機打成均質的糊狀。取4 g均質樣本于50 mL離心管中加入乙腈-二氯甲烷混合液(乙腈∶二氯甲烷=1∶4)16 mL，充分渦旋5 min，15 ℃，5 000 r/min，離心10 min，取8 mL有機相至干燥容器中，旋轉蒸發至干，用2 mL 0.02 mol/L PBS溶解干燥的殘留物，加入2 mL正己烷，充分混合30 s，15 ℃，5 000 r/min，離心5 min，去除上層，取下層PBS液體用于檢測分析。

1.9 添加回收試驗

在標準曲線線性范圍內，根據高、中、低的添加濃度原則，向空白雞肉樣品中加入不同濃度的沙拉沙星藥物，每個濃度設置5組平行試驗。按照1.8的樣品處理方法，采用dc-CLEIA方法檢測實際樣品中的藥物濃度，最后根據計算公式計算出各添加濃度的回收率和變異系數。

回收率=(實際濃度的平均值/添加濃度)×100%；變異系數=(實際濃度的標準差/實際濃度的平均值)×100%。

2 結果與分析

2.1 酶標抗體McAb-HRP的鑒定

2.1.1 紫外掃描鑒定

取SAR-Ab、HRP和McAb-HRP的PBS溶液，在220～440 nm范圍內進行紫外掃描，紫外掃描結果見圖1，譜圖顯示SAR-Ab在波長278 nm處有個最大吸收峰，HRP在403 nm處有個最大吸收峰，McAb-HRP則分別在277和402 nm處各有個最大吸收峰，可初步判斷酶標抗體偶聯成功。

圖1 McAb-HRP偶聯紫外掃描分析

2.1.2 間接ELISA鑒定及其效價測定

運用間接ELISA鑒定McAb-HRP是否偶聯成功，結果如表1，包被SAR-1-OVA孔的OD450較包被OVA孔大，說明酶標抗體可以與SAR-1-OVA特異性結合，并且能與四甲基聯苯胺(TMB)發生顯色反應，由此進一步證明了酶標抗體偶聯成功，且在包被原SAR-1-OVA濃度為2.5 μg/mL時，酶標抗體效價達到了1∶32 000。

表1 McAb-HRP鑒定結果

2.2 dc-CLEIA檢測方法的建立

2.2.1 最佳包被抗原濃度及最佳酶標抗體稀釋度的確定

根據初步選擇的包被抗原濃度1.25 μg/mL及酶標抗體稀釋度1∶8 000，進一步選取3個包被抗原濃度2.5、1.25、0.625 μg/mL以及3個酶標抗體稀釋度1∶4 000、1∶8 000、1∶12 000，同時使沙拉沙星標準品的終濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 ng/mL，根據dc-CLEIA的操作步驟，進行藥物競爭抑制試驗，最后根據RLU值，計算出在不同包被原濃度及酶標抗體稀釋比下的IC50，結果如表2。在包被原濃度為1.25 μg/mL，酶標一抗的稀釋度為1∶8 000時，IC50最低，故選其為最佳工作條件。

表2 不同包被抗原濃度及酶標抗體稀釋度下的IC50

2.2.2 dc-CLEIA標準曲線的建立

如圖2，沙拉沙星在線性范圍濃度0.312～20 ng/mL內建立標準曲線，其結合率與沙拉沙星標準品濃度的對數值呈線性關系，回歸方程為y=-0.373x+0.688(R2=0.985)，經計算，其IC50為3.19 ng/mL。

圖2 沙拉沙星dc-CLEIA 標準曲線

2.3 精密度試驗

用不同濃度的鹽酸沙拉沙星標準品進行競爭抑制，對所得的RLU值進行批內和批間變異系數分析，來表示此方法的精密度。變異系數=[SD的平均值/(1.414×平均結合率)]×100%。沙拉沙星標準品各濃度下的結合率和變異系數見表3。經計算，平均批內變異系數為4.68%，平均批間變異系數為6.13%，平均批內批間變異系數均低于7%，由此說明該方法精密度良好。

表3 dc-CLEIA批內批間誤差

2.4 特異性試驗

由表4可知，SAR-Ab與二氟沙星的交叉率較高，與其他10種氟喹諾酮類藥物的交叉反應率均低于8%，與其余4種其他抗生素的交叉反應率極低，表示SAR-Ab能特異性的識別沙拉沙星與二氟沙星。

表4 SAR-Ab特異性試驗檢測結果

2.5 二氟沙星標準曲線的建立

以二氟沙星不同濃度標準品的對數值為橫坐標，以結合率B/B0作為縱坐標，建立了二氟沙星直接競爭化學發光標準曲線，如圖3。二氟沙星在線性范圍濃度0.312～20 ng/mL內，其結合率與二氟沙星不同濃度標準品的對數值呈線性關系，回歸方程為：y=-0.369x+0.719(R2=0.994)，經計算，其IC50為3.94 ng/mL。

圖3 二氟沙星 dc-CLEIA 標準曲線

2.6 最低檢出限試驗

表5 各空白值檢測結果

2.7 添加回收試驗

在空白雞肉中，分別添加沙拉沙星和二氟沙星，在0.312～20 ng/mL的線性范圍內，均設置20、5、2.5、0.5 μg/kg 4個添加濃度，作dc-CLEIA檢測，結果見表6。經計算得出沙拉沙星在雞肉中的回收率為88.2%～108.3%，其變異系數≤10.28%；二氟沙星在雞肉中的回收率為93.36%～102.7%，其變異系數≤13.4%。

表6 添加回收試驗結果

3 討論

本研究采用改良的過碘酸鈉法，合成偶聯物McAb-HRP，經紫外掃描及直接ELISA 鑒定偶聯成功，且在包被抗原SAR-1-OVA濃度為2.5 μg/mL時，酶標抗體的效價達到了1∶32 000，說明偶聯效率較高。通過棋盤法，確定了最佳包被抗原濃度以及最佳酶標抗體稀釋度分別為1.25 μg/mL、1∶8 000，在此基礎上建立了dc-CLEIA分析方法，其標準抑制曲線y=-0.373x+0.688 (R2=0.985)，靈敏度IC50為3.19 ng/mL，樣品最低檢出限為1.25 μg/kg。劉儒彪等[24]制備的沙拉沙星ELISA檢測試劑盒的靈敏度IC50為4.11 ng/mL，其最低檢出限為2.06 ng/mL。根據穆國冬[25]建立的間接競爭ELISA標準曲線y=-24.566x+94.216，R2=0.998，可計算出其靈敏度IC50為3.81 ng/mL，其最低檢出限為1.55 ng/mL。由此可看出本研究中建立的dc-CLEIA分析方法，靈敏度高于ELISA方法。本試驗建立的dc-CLEIA檢測方法，其精密度試驗結果顯示，其批內、批間變異系數均低于7%，由此說明此方法重復性良好。而特異性結果顯示，除與二氟沙星的交叉反應率高達80.96%外，與其他氟喹諾酮類藥物的交叉反應率均低于8%，而這正是因為拉沙星是二氟沙星的活性代謝物。這兩種氟喹諾酮類藥物不同于其他氟喹諾酮類藥物的地方在于前者在其N1位上帶有一個苯環結構，從而對整個藥物分子的空間結構影響較大，故制備的SAR-Ab對二氟沙星的交叉反應率較其他氟喹諾酮類藥物高出許多。由此建立了二氟沙星的抑制標準曲線，線性范圍為0.312～20 ng/mL，線性方程為y=-0.369x+0.719(R2=0.994)，靈敏度IC50為3.94 ng/mL。最后在雞肉樣本中對沙拉沙星和二氟沙星進行添加回收試驗，結果顯示，沙拉沙星在雞肉中的回收率為88.2%～108.3%，其變異系數≤10.28%；二氟沙星在雞肉中的回收率為93.36%～102.7%，其變異系數≤13.4%。由此表明，本試驗建立的dc-CLEIA分析方法精密度、特異性良好，靈敏度高。

化學發光酶聯免疫方法具備靈敏度高、特異性強，且能快速大量的檢測，無需復雜耗時的樣品前處理，能滿足市場大量檢測需求，其次化學發光值能夠達到6個數量級，測定范圍更寬。化學發光酶聯免疫分析方法可分為直接法和間接法，各有其優缺點。本研究中建立的dc-CLEIA方法的靈敏度相較于本實驗室建立的間接競爭化學發光酶聯免疫方法(ic-CLEIA)的靈敏度1.45 ng/mL低，但也完全能滿足國家農業農村部對于沙拉沙星樣品殘留檢測要求，dc-CLEIA優點在于省去了酶標二抗的孵育時間，故在檢測時間上優于ic-CLEIA。而ic-CLEIA因為有一抗和酶標二抗反應的放大效應，所以其靈敏度明顯優于dc-CLEIA。在實際的運用當中，可根據兩種方法的優點來選擇具體的檢測方法。