非洲豬瘟病毒p11.5蛋白的表達及其單克隆抗體的制備

趙少若,梁嚴予,鄭丁丁,王彥偉,郝麗影, 逄文強, 鄧均華*, 田克恭,*

(1. 洛陽普泰生物技術有限公司，河南 洛陽 471000；2. 國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471000)

非洲豬瘟(African swine fever)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV) 引起的一種烈性、傳染性強的動物疫病，可感染所有品種和年齡的家豬、野豬，發病率和死亡率最高可達100%，癥狀與傳統豬瘟相似，以全身出血、呼吸障礙和神經癥狀為主要特征[1-3]。非洲豬瘟于1921年在非洲肯尼亞首次被發現，此后傳入歐洲和美洲多個國家，2000年后在臨近中國的俄羅斯、烏克蘭陸續暴發。2018年我國沈陽市首次報道非洲豬瘟疫情，隨后全國各地陸續發生，對我國養豬業和國民經濟造成巨大損失[4-5]。

ASFV為非洲豬瘟科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是一種獨特又復雜的病毒，可感染軟蜱，同時在脊椎動物和無脊椎動物中復制[6-8]。ASFV為有囊膜的二十面體對稱的雙股DNA病毒，外形為正六邊形，直徑175～215 nm，基因大小介于170～190 kb之間，包含151個開放閱讀框，基因組編碼150～200個蛋白[9-11]。目前對ASFV病原特性和致病機制的認識并不充分，仍無有效的治療或預防措施，為了更深入地研究該病毒，研究者們已經確認了多個ASFV結構蛋白，p11.5是結構蛋白中的一種，產生于病毒感染的晚期，分子量為12～13 kDa，是病毒的結構組成部分之一[12]，但是目前針對該蛋白的報道較少。本研究通過構建重組原核質粒pET28a-SUMO-p11.5進行原核表達，對重組蛋白SUMO-p11.5進行純化，制備了針對p11.5蛋白的單克隆抗體，為p11.5蛋白生物學功能的研究、ASFV致病機制及診斷試劑產品的研發提供了重要的生物材料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑

大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態細胞和質粒提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；pET28a-SUMO質粒，由國家獸用藥品工程技術研究中心構建并保存；限制性內切酶和T4 DNA連接酶，購自ThermoFisher Scientific；Bicinchoninic acid(二喹啉甲酸，簡稱BCA)蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG、HRP標記的羊抗豬IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗鼠IgG，購自Sigma公司；豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)96孔抗原板由國家獸用藥品工程技術研究中心提供；液體石蠟，購自北京陸橋技術股份有限公司；小鼠單抗Ig類/亞類/亞型鑒定用ELISA試劑盒，購自洛陽佰奧通實驗材料中心；非洲豬瘟參考陽性血清、ASFV 96孔抗原板來源于歐盟非洲豬瘟參考實驗室(Centro de Investigación en Sanidad Animal，CISA-INIA，Madrid，Spain)。

1.3 表達菌株的構建

根據GenBank中ASFV SY-18毒株全基因序列(GenBank:MH766894.1)，運用在線軟件(http://www.jcat.de/)對基因序列進行大腸桿菌密碼子優化，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成p11.5基因序列，堿基序列414 bp。用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引入酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ，上游引物為p11.5-BamHⅠ-F：5′-CGGGGGATCCATGGAAGCTGTTCT-3′(下劃線為酶切位點BamHⅠ),下游引物為p11.5-XhoⅠ-R：5′-GCCGCTCGAGTTAACCTTCTTTGATGTT -3′(下劃線為酶切位點XhoⅠ)。以合成的pUC57-ASFV p11.5為模板，用引物p11.5-BamHⅠ-F和p11.5-XhoⅠ-R進行p11.5基因的PCR擴增。擴增的目的基因進行膠回收純化，用限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ對純化后的目的基因和pET28a-SUMO載體分別進行酶切消化，消化后的目的基因和載體經T4 DNA連接酶連接后，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，37 ℃靜置培養10～12 h至單菌落清晰可辨。挑取單菌落擴大培養后，提取質粒進行雙酶切鑒定和測序驗證。將鑒定正確的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，即為重組蛋白SUMO-p11.5的表達菌株。

1.4 重組蛋白SUMO-p11.5的表達與純化

取2 mL大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-SUMO-p11.5菌種，接種至200 mL含卡那霉素的LB液體培養基中，置于37 ℃恒溫搖床，220 r/min振蕩培養至OD600 nm值為0.8～1.0時，加入終濃度0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)溶液誘導，28 ℃培養12 h。收集菌液，離心后棄掉上清，菌體沉淀用高壓勻質機破碎后，離心收集上清和沉淀，分別制備蛋白電泳樣品，進行SDS-PAGE分析，檢測重組蛋白表達情況。菌體裂解上清液中加入0.01 mol/L咪唑，使用0.45 μm濾器過濾后，采用鎳柱親和層析法進行蛋白純化，純化后的蛋白用SDS-PAGE檢測，并經光譜掃描法確定其純度，以及BCA法進行蛋白定量后，將純化蛋白進行分裝后置于-80 ℃保存備用。

1.5 重組蛋白SUMO-p11.5的Western blot鑒定

純化的重組蛋白SUMO-p11.5進行SDS-PAGE后，將凝膠用半干式轉膜法電轉至硝酸纖維素膜(NC膜)。轉印的NC膜用含5%脫脂奶粉的PBST封閉，4 ℃封閉過夜，一抗為非洲豬瘟參考陽性血清，1∶500稀釋后室溫孵育1 h，二抗為HRP標記的羊抗豬IgG，1∶2 500稀釋后室溫孵育1 h，避光條件下加入DAB顯色液，進行顯色觀察結果。

1.6 單克隆抗體的制備

1.6.1 動物免疫及間接ELISA篩選方法的建立

取4～6周齡雌性BALB/c小鼠，背部皮下多點免疫重組蛋白SUMO-p11.5，免疫劑量為100 μg/只。首次免疫，使用弗氏完全佐劑與重組蛋白SUMO-p11.5等體積混合乳化；第二次及之后免疫，使用弗氏不佐劑與重組蛋白SUMO-p11.5等體積混合乳化。免疫間隔2周，三免后7 d采血，用間接ELISA法檢測血清抗體效價。包被純化的重組蛋白SUMO-p11.5于酶標板，將蛋白濃度稀釋至0.5 μg/mL，100 μL/孔，將待檢小鼠血清進行梯度稀釋，將稀釋后的血清作為一抗，同時設置陰性對照，37 ℃孵育1 h；用PBST洗板4次，加入二抗HRP標記的羊抗鼠IgG，按1∶10 000稀釋，100 μL/孔；洗板4次，分別加入顯色劑A液、B液，50 μL/孔，37 ℃孵育15 min；最后加入2 mol/L H2SO4終止反應，50 μL/孔，在酶標儀上讀數。當陰性對照OD450 nm<0.2時試驗成立，S/N(待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm)≥2.1判為陽性，S/N<2.1判為陰性，以陽性孔對應的最高稀釋度作為待檢血清的抗體效價。選擇抗體效價最高的小鼠進行沖擊免疫，小鼠腹腔注射純化的重組蛋白SUMO-p11.5，100 μg/只，3 d后進行細胞融合。

1.6.2 細胞融合及篩選

細胞融合前1 d取小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養層細胞，采用雜交瘤技術進行細胞融合，將狀態良好的SP2/0細胞，與小鼠脾細胞以1∶10的比例混合，以聚乙二醇(PEG)1500作為融合劑，按常規步驟進行操作[13]，融合后的細胞鋪于準備好的飼養細胞上。8～10 d后取96孔板細胞上清，用1.6.1建立的間接ELISA方法進行檢測，同時將大腸桿菌重組蛋白BL21/pET28a-SUMO包被酶標板作為非特異對照板，包被濃度均為0.5 μg/mL，小鼠融合血清作為陽性對照。以重組p11.5蛋白檢測孔的OD值與非特異蛋白對照孔OD值的差值，作為該孔的A值，選擇A值較高的細胞孔，用有限稀釋法進行亞克隆，3～5次亞克隆后待雜交瘤細胞上清陽性率為100%，細胞長勢均一狀態較好時，對陽性雜交瘤細胞進行擴大培養及凍存，并收集細胞上清。

1.6.3 腹水的制備

取6～8月齡BALB/c經產母鼠，腹腔注射無菌液體石蠟，0.5 mL/只。7 d后對小鼠腹腔注射0.5 mL細胞密度為30萬/mL的雜交瘤細胞。待小鼠腹部明顯膨大時，從腹部抽取腹水，12 000 r/min離心10 min，收集上清于-80 ℃保存。

1.7 單克隆抗體的鑒定

1.7.1 單克隆抗體效價的測定

采用1.6.1建立的間接ELISA法測定腹水效價，同時用大腸桿菌重組蛋白BL21/pET28a-SUMO包被酶標板，作為非特異對照。將梯度稀釋后的腹水作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗，按照上述操作方法進行檢測，將對照值高的單克隆抗體棄掉，進一步排除非特異。

1.7.2 單克隆抗體亞類的鑒定

按照亞類鑒定試劑盒說明書操作步驟，對獲得的單克隆抗體輕重鏈進行亞類鑒定。

1.7.3 單克隆抗體特異性鑒定

使用CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PEDV制備的96孔抗原板，檢測單克隆抗體的特異性。同時設置陽性對照，CSFV、PRRSV為相應的陽性血清(由國家獸用藥品工程技術研究中心提供)，PRV、PCV2、PEDV為相應的陽性單克隆抗體[14-16]，并用PBS作為陰性對照，按間接免疫熒光試驗(IFA)常規步驟進行檢測。

1.7.4 單克隆抗體IFA鑒定

將商品化ASFV 96孔抗原板取出回溫后，用PBS潤洗1次，分別加入一定稀釋倍數的腹水，并設置陰性對照孔，置于37 ℃培養箱孵育1 h；PBS洗滌3次，加入FITC標記的兔抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育50 min；PBS洗滌3次后，孔內加入適量PBS于熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果與分析

2.1 重組質粒的構建與鑒定

用p11.5 F/R引物以合成的p11.5基因為模板進行PCR擴增，獲得大小為414 bp的目的片段(圖1)，與預期大小一致。將構建好的重組質粒pET28a-SUMO-p11.5進行雙酶切鑒定，核酸電泳可觀察到載體條帶和目的條帶(圖2)，說明目的基因與載體正確連接。經測序鑒定分析，結果與p11.5目的基因堿基序列一致，表明重組質粒構建成功。

M. DNA Marker; 1. p11.5基因

M. DNA Marker;1. pET28a-SUMO-p11.5雙酶切

2.2 重組蛋白的表達、純化與鑒定

經SDS-PAGE檢測，與誘導前相比，IPTG誘導后的菌體破碎液上清有明顯目的蛋白。誘導表達的重組蛋白SUMO-p11.5分子量大約在30 kDa，且為可溶性表達(圖3)。采用鎳柱親和層析法純化上清中的可溶蛋白，純化后蛋白純度約90%(圖4A)。經Western blot鑒定，表達的重組蛋白SUMO-p11.5能夠與ASFV標準陽性血清反應，顯示出特異性的條帶(圖4B)，結果表明重組蛋白SUMO-p11.5具有良好的反應原性。

M. 蛋白分子量Marker;1. 誘導前的大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-SUMO-p11.5菌體破碎液上清;2. 誘導后的大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-SUMO-p11.5菌體破碎液上清

2.3 單克隆抗體制備及效價檢測

經過篩選獲得4株能穩定性分泌抗p11.5蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，分別命名為1G6、3D2、5F2、5E12，將這4株雜交瘤細胞制備了小鼠腹水，并進行ELISA效價檢測，結果顯示，制備的腹水ELISA效價均不低于1∶102.4×104。

2.4 單克隆抗體亞類鑒定

對制備的單克隆抗體進行亞類鑒定，3株單克隆抗體重鏈亞類為IgG1，1株重鏈為IgG2a，輕鏈亞類均為κ。

2.5 單克隆抗體特異性鑒定

取CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PEDV 96孔抗原板分別檢測4株單克隆抗體，結果陽性對照孔均可見明顯的熒光，陰性對照孔和單克隆抗體檢測孔均無可見熒光，結果表明4株單克隆抗體均不與CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PEDV發生反應，以單克隆抗體1G6示例(圖5)。

A,B,C,D,E. 相應病毒抗體檢測陽性對照；F,G,H,I,J. PBS處理陰性對照；K,L,M,N,O. 單克隆抗體1G6與不同病毒反應結果

2.6 單克隆抗體與ASFV反應性鑒定

利用商品化ASFV 96孔抗原板，對獲得的4株單克隆抗體進行IFA鑒定，同時將非ASFV源單克隆抗體作為陰性對照。結果顯示4株單克隆抗體均能在熒光顯微鏡下觀察到特異性的綠色熒光，陰性對照孔無綠色熒光，以單克隆抗體1G6示例(圖6)。

A. 單克隆抗體1G6;B. 陰性對照

3 討論

目前非洲豬瘟已在30多個國家發生流行，并有繼續擴大蔓延的趨勢，該病傳染性強，患豬出現高熱、食欲廢絕、皮膚發紺、內臟器官嚴重出血等臨床癥狀，具有發病病程短、病死率高等特征[17-18]。鑒于該病的嚴重危害性，OIE將其列為法定報告的烈性傳染病之一，我國將其列為一類動物疫病。由于ASFV的復雜性和特殊性，目前尚無有效的治療藥物和商品化疫苗，一旦發病，只能依靠隔離、撲殺、限制流通來防止疫情蔓延。因此，建立快速而有效的檢測方法是防止非洲豬瘟發生大范圍暴發的有效手段[19-20]。

非洲豬瘟常采用如紅細胞吸附試驗、直接免疫熒光試驗、核酸檢測試驗、IFA、ELISA等方法進行診斷[21]，國際上缺乏相關特異性試劑，對非洲豬瘟的防控帶來許多困難。ASFV病毒復制是調控病毒基因轉錄的開關，極早期和早期基因在病毒復制前進行轉錄表達，而中期和晚期基因在病毒復制開始后進行轉錄表達。p11.5基因比較穩定，在病毒DNA合成開始后被翻譯，因此屬于晚期病毒基因類別。該蛋白在感染細胞中定位于病毒工廠，并組裝進入病毒顆粒，是病毒的結構組成部分，在感染細胞中非常豐富，因此，p11.5具有作為診斷抗原的潛質[22]。本研究利用大腸桿菌表達系統成功表達出ASFV p11.5蛋白，且為胞質內可溶性表達。經過Western blot分析，重組蛋白可以和ASFV標準陽性血清發生反應，有良好的反應原性。以重組蛋白p11.5蛋白免疫小鼠制備了4株針對該蛋白的單克隆抗體，間接ELISA方法檢測獲得的單克隆抗體效價均不低于1∶102.4×104。經單克隆抗體亞類鑒定，3株單克隆抗體重鏈亞類為IgG1，1株重鏈亞類為IgG2a，輕鏈亞類均為κ。間接免疫熒光試驗結果顯示，4株單克隆抗體均不與CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PEDV反應，但均能與ASFV反應，表明制備的單克隆抗體具有良好的特異性與反應性。

本研究成功表達了可溶性的ASFV p11.5蛋白并制備了針對p11.5的單克隆抗體，經鑒定具有較高的效價且特異性良好，為p11.5蛋白的結構功能等基礎研究，以及ASFV免疫類診斷試劑產品的開發提供了重要的生物材料。