江蘇地區雞傳染性支氣管炎核酸檢測及其病毒分離株鑒定和基因序列分析

武小琰，張瀟，何旭暉，林建，楊倩

(南京農業大學，江蘇 南京 210095)

傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)為冠狀病毒科丙型冠狀病毒屬的典型代表種[1]，是影響世界養雞業的主要病原之一。該病毒引起的雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis)是一種接觸傳染性、病毒性呼吸道疾病[2]。IBV主要侵害家禽呼吸系統、消化系統及泌尿生殖系統，臨床上對蛋雞的危害最為嚴重[3-4]。低于2周齡的雞感染IBV后可能引起輸卵管永久損傷，導致產蛋能力下降或喪失。9～18周齡的蛋雞感染IBV會引起產蛋率顯著下降(高達50%)，病程持續8周以上，常出現軟殼畸形蛋，蛋清呈水樣。IBV暴發后相當長的一段時間內，雞蛋質量低且蛋殼不平整，對養殖戶造成巨大損失。目前，研究的主要重點在于IBV的變異性、致病性及預防控制對策。IBV疫苗免疫保護效果并不理想，原因主要有兩點：其一，IBV基因組的RNA酶缺乏嚴密的校正功能，所以該病毒極易發生突變[5]；其二，該病毒的基因型、血清型復雜，不同血清型之間無交叉反應或交叉反應很小，所以IBV在全球范圍內存在廣泛流行，影響養禽業發展[6-7]。

IBV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長27.6 kb左右，至少有10個開放閱讀框(ORF)，編碼小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和纖突蛋白(S)4種主要結構蛋白[8]。其中，S蛋白是決定IBV血清型的主要蛋白，對IBV的傳染性、致病性、組織嗜性起著決定性作用，同時能誘導機體產生中和抗體和血凝抑制抗體，是IBV的保護性抗原[9]。因此，S基因的核苷酸序列是IBV分離株分型的重要依據。S蛋白的抗原位點和高變區主要集中位于S1蛋白，當S1蛋白發生基因缺失、插入、重組或突變，就會出現新的血清學和基因型[10]。因此S1基因是研究IBV遺傳變異與進化的指示基因，分析S1基因序列有助分析IBV的流行趨勢[11]。

為了解江蘇省產蛋雞IBV的流行情況及發展態勢，為下一步的防控工作提供參考，本研究采集了江蘇省13個地級市的拭子樣品進行檢測。在此基礎上對呈IBV陽性的樣品進行病毒分離與鑒定，并對IBV分離株進行全基因測序和S1基因分析，初步明確了江蘇分離株遺傳演化特點，為下一步防控工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020年11月，對從江蘇省內13個地級市20個家禽養殖場進行樣品采集。采集到雞咽拭子及泄殖腔拭子共計625份，其中泄殖腔拭子314份，咽拭子311份。樣品主要來自規模化養殖場，共有573份，其余來自散養戶的樣品共有52份。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；TRIzol試劑、反轉錄試劑盒、DL2000 DNA Maker，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自康為世紀有限公司；瓊脂糖，購自翌圣生物科技(上海)有限公司；50×TAE Buffer、10×PBS，購自Biosharp公司；LB液體培養基；雞胚由江蘇省農業科學院提供。

1.3 采集拭子樣品的RT-PCR檢測

將采集的拭子樣品浸置于500 μL 1×PBS，渦旋振蕩20 s，于4 ℃靜置20 min，再次渦旋振蕩20 s，得到樣品拭子浸出液。取200 μL拭子浸出液，參照DNA/RNA快速提取試劑盒說明書提取核酸。檢測核酸濃度，去除核酸濃度低于檢出下限的樣品。根據GenBank上公開的IBV QX亞型序列及M41序列設計引物(表2)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以拭子樣品浸出液為模板，參照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，得到cDNA進行PCR擴增，PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火15 s，72℃延伸2 min，進行35個循環72 ℃延伸10 min，得到PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表2 引物序列

1.4 病毒分離及RT-PCR鑒定

將本次試驗中RT-PCR鑒定為IBV陽性的樣品12 000 r/min，離心5 min，收集上清，經0.22 μm濾膜過濾后接種于11日齡的雞胚，接種病料后48 h后收取尿囊液。用TRIzol法提取尿囊液樣品核酸，參照諾唯贊反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA。用特異性引物進行PCR擴增，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取單一目的條帶，參照Gel Extraction Kit 快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行膠回收，回收產物由上海生工生物工程有限公司測序。

1.5 病毒分離株的全基因組測序及序列分析

1.5.1 引物設計及合成

IBV基因組序列從5′→3′順序依次為：5′-UTR-1a-1b-S-3a-3b-3c(E)-M-5a-5b-N-UTR-3′，將其分為7個片段，根據GenBank中公布的IBV基因組序列，利用SnapGene軟件設計針對IBV全基因序列的7對特異性引物，引物信息見表3，引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.5.2 IBV分離株的全基因組序列分析

通過DNAMAN軟件對測序結果進行拼接整理。以NCBI數據庫中下載的18株IBV全基因序列作為本研究的參考毒株(表4)，通過MEGA-X軟件的Neighbor-Joining算法繪制基于全基因序列的進化樹，并使用BioEdit軟件進行核酸及氨基酸同源性比對。

表4 IBV參考毒株全基因的信息

1.5.3 IBV分離株基于S1基因的遺傳進化分析

從全基因組序列中截取S1基因序列。從NCBI數據庫中下載36株IBV S1基因序列作為本研究的參考毒株(表5)。通過MEGA-X軟件Neighbor-Joining算法構建基于S1基因序列的系統進化樹。使用BioEdit軟件進行核苷酸序列和氨基酸序列同源性比對分析。

表5 IBV參考毒株S1基因的信息

2 結果與分析

2.1 采集拭子樣品的RT-PCR檢測

以江蘇省各地區拭子樣品為模板進行RT-PCR鑒定，擴增產物經凝膠電泳檢測。QX亞型檢測結果顯示：產物呈單一條帶，大小約為211 bp，與目的條帶大小相符(部分樣本的擴增結果見圖1)。將目的條帶切膠回收，測序證實擴增產物為IBV QX亞型。M41未檢出。

M.DL2000 DNA Marker；1～23.部分拭子樣品；24.陰性對照

江蘇省13個地級市的IBV核酸檢出結果如表6所示，2020年11月共計625份樣品中，除去核酸濃度低于檢出下限的120份樣品，余下的505份樣品平均IBV QX亞型陽性檢出率為14.46%(73/505)。根據樣品采集地區進行分類，檢出率由高至低依次為無錫 100%(60/60)、常州 20%(8/40)、南京 8%(2/23)、鹽城 4.1%(3/72)，其余檢測點IBV核酸檢測無陽性結果。依據養殖類型來看，檢測出IBV核酸陽性的雞場均為規模化養殖場。

表6 IBV QX亞型核酸檢測陽性結果

2.2 IBV分離株全基因序列測序

采用本研究設計的IBV全基因7個片段設計的特異性引物，對IBV分離株雞胚尿囊液進行RT-PCR檢測，所得目的片段與預期大小一致。通過DNAMAN軟件對測序結果進行拼接整理，確定本研究分離的IBV江蘇分離株全基因組大小為27 689 bp，其中S1基因的全長為1 620 bp，命名為NEWQXIBV。

2.3 IBV分離株全基因組序列分析

為了研究本試驗分離得到的IBV分離株與我國早期毒株以及與其他各國毒株之間的遺傳演化關系，將分離株的全基因序列與各參考毒株的全基因序列構建系統進化樹，結果如圖2。分離毒株和所有參考毒株形成7個不同的進化分支(基因型)，分別為基因型GⅠ～GⅦ[12]，分離株與基因型GⅠ(類QX型)親緣關系最近。

▲本研究分離鑒定毒株。下同

2.4 IBV分離株基于S1基因的遺傳演化分析

根據分離株S1基因繪制的系統進化樹，結果見圖3。分離毒株和所有參考毒株形成7個不同的進化分支(基因型)，分別為基因型GⅠ～GⅦ型，分離株與GⅠ型(類QX型)親緣關系最近。通過同源對比發現，分離株與GⅠ型參考代表毒株QXIBV核苷酸和氨基酸的同源性分別為94%和96.2%(如圖4、圖5)。推導的氨基酸序列顯示，分離株S1基因裂解位點為HRRRR，與GⅠ分支所有參考毒株裂解位點一致，為中國IBV毒株所特有。

圖3 分離株S1基因與參考株全基因序列系統進化樹

圖4 IBV分離株與參考毒株S1基因氨基酸序列同源性比對分析

圖5 IBV分離株與參考毒株S1基因核苷酸序列同源性比對分析

3 討論

近年來，我國養雞業不斷向規模化、集約化方向發展，合理的養殖方式和及時的疫病監測為家禽養殖提供了科學保障。隨著養殖戶防控意識提高，對養雞業造成影響的部分疫病已經得到有效控制，但仍有一些傳染病對養雞業產生威脅。影響蛋雞養殖的傳染病病原通常存在于被感染家禽的消化道、呼吸道和內臟組織器官中，因此病原可以隨病禽的眼、鼻、口腔分泌物及糞便排出，被污染的任何物體都可以傳播病原。了解傳染性支氣管炎的流行情況及發展態勢，才能有針對性的加強防控。為了解江蘇地區傳染性支氣管炎流行情況，本研究對江蘇省13個地級市的蛋雞雞群進行流行病學調查和分析。結果表明江蘇地區IBV QX亞型的平均陽性率為14.46%，而M41亞型未檢出，說明江蘇地區的IBV仍然以QX型為主。

自20世紀30年代被發現以來，IBV在幾乎所有的養雞國家存在。IBV不同的血清型和遺傳型的病毒已經在世界范圍內被鑒定出來，大多數情況下不具有交叉保護作用。截至目前，中國至少存在3種基因型[13]，16個譜系，超過70%的傳染性支氣管炎病例都是QX型的病毒引起[14]。目前我國使用的活疫苗屬于Mass血清型，該疫苗自1960年研制成功并應用至今[15]，被證明是所有傳染性支氣管炎疫苗中效果最好、保護范圍最廣的疫苗，但該血清型與我國流行的QX型同源性較差[2]，傳染性支氣管炎極難得到有效控制。

本研究通過SPF雞胚接種和雞胚尿囊液的RT-PCR鑒定，于江蘇省各地區IBV陽性的樣品中分離病毒，并對其全基因進行序列測序，得到1株全長27 689 bp的IBV全基因組序列。基于S1基因進行核苷酸和氨基酸同源性比對，結果表明IBV分離株序列與GⅠ-19譜系(QX型)參考毒株間核酸和氨基酸同源性最高，為94%和95.4%，且具有相同的HRRRR裂解位點特征，屬于基因型Ⅰ(類QX型)。本研究結果表明，江蘇省地區流行IBV毒株為國內優勢基因型毒株，現有Mass型疫苗可能難以起到免疫保護作用，因此有必要對江蘇省IBV進行持續的流行病學監測。建議蛋雞養殖場做好防控，選擇針對流行毒株的本地疫苗，可有效提高疫苗免疫保護率，減少養殖戶經濟損失。