不同輔料硝酸咪康唑乳膏微生物限度檢查方法適用性研究

琚瀅鎣，李亞?wèn)|，朱小磊（南陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 南陽(yáng) 473001）

硝酸咪康唑乳膏是一種常見的用于治療皮膚科及婦科疾病類非處方藥，主要用于治療由真菌、酵母菌及其他真菌引起的皮膚、指（趾）甲感染，以及由酵母菌（如假絲酵母等）和革蘭氏陽(yáng)性菌引起的陰道感染和繼發(fā)感染[1]。由于藥品具有較強(qiáng)的抑菌作用，且其基質(zhì)較為復(fù)雜，在進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性研究的時(shí)候，如果沒(méi)有采用合適的前處理方法，會(huì)發(fā)生試驗(yàn)菌回收率不符合要求，或者出現(xiàn)薄膜過(guò)濾法的過(guò)濾效率低、堵膜的情況[2]。輔料研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)濾時(shí)發(fā)生堵膜是由于硝酸咪康唑乳膏中含有卡波姆/聚丙烯酸[3]，利用氯化鈣和乳膏中的卡波姆/聚丙烯酸生成鈣鹽沉淀，避開沉淀物，取溶液過(guò)濾，即可順利地通過(guò)濾膜。本文參照2020年版《中國(guó)藥典》四部要求，根據(jù)不同廠家生產(chǎn)的硝酸咪康唑乳膏的輔料的特點(diǎn)，采用溶解、破膠、萃取、沉淀、靜置相結(jié)合的方法，對(duì)供試品做適當(dāng)前處理，解決薄膜過(guò)濾法效率差及堵膜的難題，建立適用于硝酸咪康唑乳膏的微生物限度檢查方法。

1 材料

1.1 儀器

LDZH-100L 立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），BGZ-1146 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），BCS-1300ⅡA2生物安全柜（蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），HY-4 調(diào)速多用振蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠），PYX-DHS-40x50 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），SPX-150 型生化培養(yǎng)箱（上海金慧科電子有限公司），HWS24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），JJ500 天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），JT-C 勻質(zhì)器（漯河市金田試驗(yàn)設(shè)備研究所），Htysteristest601 集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），75 單罐薄膜過(guò)濾器（北京牛牛基因技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

氯化鈣（批號(hào)：20190907）、氯化鈉（批號(hào)：MB6B206）（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），十四烷酸異丙酯（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C11291582）。硝酸咪康唑乳膏（西安楊森制藥有限公司，規(guī)格：20 g/支，批號(hào)：KCJ3SKL，KAJ0FD9，KBJ1GFV； 福 建太平洋制藥有限公司，規(guī)格：10 g/支，批號(hào)：190601，180303，200301）。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20181020）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20180806）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：20190726）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)：20200220）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20200225）、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：20200314）（青島海博生物技術(shù)有限公司）。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、白假絲酵母菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，上述菌株均來(lái)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院，工作菌株為第3 代。

2 方法

2.1 菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置35℃培養(yǎng)24 h。將白假絲酵母菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，置25 ℃培養(yǎng)3 d。分別取上述培養(yǎng)物用pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，置25℃培養(yǎng)7 d，加入5 mL 含0.05%聚山梨酯80 的pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80 的pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

2.2 供試品的制備

2.2.1 不含卡波姆/聚丙烯酸乳膏 稱取硝酸咪康唑乳膏10 g（批號(hào)：190601），加入無(wú)菌十四烷酸異丙酯和0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液各100 mL，充分震蕩萃取，靜置15 min 后取下層水相的上層溶液作為1∶10的供試液。取1∶10的供試液適量，用0.9%無(wú)菌氯化鈉稀釋成1∶20 和1∶50 的供試液。

2.2.2 含卡波姆/聚丙烯酸乳膏 稱取硝酸咪康唑乳膏10 g（批號(hào)：KCJ3SKL），加入無(wú)菌十四烷酸異丙酯100 mL，10%無(wú)菌氯化鈣溶液10 mL，再加入0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液90 mL，充分震蕩萃取，靜置15 min 后取下層水相的上層溶液作為1∶10 的供試液。取1∶10 的供試液適量，用0.9%無(wú)菌氯化鈉稀釋成1∶20 和1∶50 的供試液。

2.3 供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 平皿法

① 試驗(yàn)組：取“2.2”項(xiàng)下制備好的1∶10、1∶20 和1∶50 的供試液各9.9 mL，分別加入不大于1×104CFU·mL－1的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母菌和黑曲霉試驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻。取1 mL 注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入溫度不超過(guò)45℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖培養(yǎng)基20 mL，搖勻，待凝固后分別在35℃和25℃倒置培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

② 供試品對(duì)照組：分別取1∶10、1∶20和1∶50的供試液1mL,不加試驗(yàn)菌，方法同“試驗(yàn)組”。

③ 菌液對(duì)照組：取0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液1 mL，代替供試液，方法同“試驗(yàn)組”。

④ 陰性組：取0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液1 mL，代替供試液，不加試驗(yàn)菌，方法同“試驗(yàn)組”。

2.3.2 薄膜過(guò)濾法

① 試驗(yàn)組：取“2.2”項(xiàng)下制備好的1∶10 供試液9.9 mL，分別加入不大于1×104CFU·mL－1的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母菌和黑曲霉試驗(yàn)菌液0.1 mL，混勻。取1 mL 加入0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液100 mL 沖洗液中，薄膜過(guò)濾，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液沖洗濾膜，每次100 mL，共沖洗3 次。在最后一次沖洗液中分別加入不大于1×100 CFU·mL－1的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母菌和黑曲霉試驗(yàn)菌液1 mL。

② 供試品對(duì)照組：取1∶10 供試液1 mL，不加試驗(yàn)菌，方法同“試驗(yàn)組”。

③ 菌液對(duì)照組：取0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液1 mL，代替供試液，方法同“試驗(yàn)組”。

④ 陰性組：取0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液1 mL，代替供試液，不加試驗(yàn)菌，方法同“試驗(yàn)組”。

取過(guò)濾后的濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，分別在35℃和25 ℃倒置培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

2.4 回收率

計(jì)算各試驗(yàn)菌的回收率，若回收率在0.5～2.0范圍內(nèi)，則該方法可行。回收率＝（試驗(yàn)組菌落數(shù)－供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

2.5 控制菌的檢查

硝酸咪康唑乳膏為皮膚用藥和陰道用藥，需要控制金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌及白假絲酵母菌。采用直接接種法，取“2.2”項(xiàng)下1∶10供試液各10 mL 分別接種至100、200、400 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，再加入含菌量不大于100 CFU·mL－1的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白假絲酵母菌懸液1 mL，混勻，分別置35℃、25 ℃培養(yǎng)24 h，3 d 后分別劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂平板上。

3 結(jié)果

3.1 菌落計(jì)數(shù)方法適用性結(jié)果

硝酸咪康唑乳膏需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)微生物計(jì)數(shù)方法適用性結(jié)果分別見表1、2。從表格中可以看出，平皿法計(jì)數(shù)方法的回收率不符合要求，薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)方法的回收率均在0.5～2內(nèi)，符合《中國(guó)藥典》要求[4]，故可采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

表1 微生物計(jì)數(shù)平皿法回收率Tab 1 Recovery of plate-count method of microbial count

表2 微生物計(jì)數(shù)薄膜過(guò)濾法回收率Tab 2 Recovery of membrane filtration method of microbial count

3.2 控制菌檢查法適用性結(jié)果

硝酸咪康唑乳膏采用1∶10 供試液分別接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基各100、200、400 mL 的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于硝酸咪康唑的抑菌性，當(dāng)培養(yǎng)基體積為100 mL時(shí)，未檢出試驗(yàn)菌。當(dāng)培養(yǎng)基體積增加到200、400 mL 可檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白假絲酵母菌，故采用200 mL 培養(yǎng)基稀釋接種法對(duì)其進(jìn)行控制菌檢查，結(jié)果見表3。

表3 控制菌檢查法適用性結(jié)果Tab 3 Applicability of the specified micro-organisms test methods

4 討論

硝酸咪康唑是一種廣譜、高效的抗真菌類藥物，且對(duì)葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌也有抑制作用，當(dāng)微生物限度檢查采用普通的平皿法無(wú)法滿足試驗(yàn)菌的回收率要求，而改用薄膜過(guò)濾法，可以很好地去除其抑菌性。但由于硝酸咪康唑乳膏是黏稠的半固體制劑，需要用合適的方法進(jìn)行前處理樣品才能順利的通過(guò)濾膜。在最初試驗(yàn)過(guò)程中，采用稱取樣品10 g，加入無(wú)菌十四烷酸異丙酯和0.9%氯化鈉各100 mL 的方法處理樣品[5]，發(fā)現(xiàn)有一些產(chǎn)品無(wú)法順利通過(guò)濾膜，堵塞很嚴(yán)重。又嘗試添加聚山梨酯80，提高沖洗液溫度至45℃[6]，供試液仍然不能快速通過(guò)濾膜。

對(duì)比不同廠家硝酸咪康唑乳膏的成分表發(fā)現(xiàn)，難以通過(guò)濾膜的樣品均含有聚丙烯酸或卡波姆（丙烯酸交鏈共聚物），均為高分子聚合物，是常用的增稠劑，易溶于水，增加水相的黏稠度，使得供試液難以通過(guò)濾膜。利用氯化鈣與聚丙烯酸/卡波姆形成鈣鹽沉淀，從而達(dá)到破膠的目的，吸取水相上清液，避開沉淀物，即可順利地通過(guò)濾膜[2]。因此建議藥品檢驗(yàn)人員在面對(duì)不同廠家的同一品種藥品時(shí)，應(yīng)該根據(jù)輔料的理化特性，依照藥典規(guī)定，靈活選用適宜的前處理方法，順利解決樣品的抑菌性、難以過(guò)濾等問(wèn)題。

另外，在對(duì)比各個(gè)企業(yè)的硝酸咪康唑乳膏微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)報(bào)告時(shí)，發(fā)現(xiàn)一些廠家忽略了硝酸咪康唑治療陰道炎的用法，而忽略了陰道給藥制劑應(yīng)不得檢出白假絲酵母菌的規(guī)定[4]。暴露了一些企業(yè)在進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性時(shí)不夠嚴(yán)謹(jǐn)、規(guī)范，無(wú)法很好地保證藥品質(zhì)量。藥品微生物控制也是藥品質(zhì)量保證的重要組成部分，藥品污染微生物不僅直接影響藥品的有效性，更有可能危及用藥患者的生命安全。因此建議廠家一定要嚴(yán)格按照藥典要求的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性研究。