周叢生物對稻田氨揮發的影響*

趙婧宇，韓建剛，孫朋飛，吳永紅

（1. 南京林業大學生物與環境學院，南京 210037；2. 中國科學院南京土壤研究所，南京 210008）

周叢生物是普遍生長的稻田水-土界面的一種由微藻、細菌、真核微生物、原生動物、后生動物以及其他自養和異養微生物組成的微生物聚集體[13]。現有研究發現，周叢生物對于調控氮、磷等養分在水土之間的遷移和轉化方面發揮著重要作用[14]。微生物吸收氮和磷以使其生長，并保留營養物質作為其生物質的一部分[15-16]，而微生物死亡后，氮將作為有機肥料釋放回土壤中。研究表明，許多藍細菌物種能夠通過固氮提高農業領域的氮利用率[17]，這種養分利用效率的提高，有效減少了因農田徑流、揮發或者是下滲損失的養分。周叢生物中的藻類是其在氮素循環中起到關鍵作用的成分，藻類在一定程度上會增加水體中的pH，這可能會促進水體中的尿素水解，尤其是在添加高濃度氮素的情況下[18-19]。周叢生物可以在一定程度上減少水體和土壤中的氮素濃度，另一方面又會促進水體pH和尿素的水解，增加水體中的氮濃度，因此，周叢生物在對氨揮發上的作用是促進還是抑制尚不明確。基于以上研究背景，本研究擬通過大田微區實驗揭示以下問題：（1）周叢生物能否影響稻田氨揮發；（2）周叢生物影響稻田氨揮發的驅動因素與潛在機制，以期尋找新的能夠有效抑制稻田氨揮發的技術突破口，助力水稻生產的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗點位于遼寧省沈陽市蘇家屯區十里河鎮沈陽生態實驗站（北緯41°31′，東經123°24′），平均海拔41 m，屬溫帶半濕潤大陸性季風氣候，四季分明，雨熱同期。年均溫7～8 ℃，大于10 ℃的年活動積溫3 100～3 400 ℃，年總輻射量120～135 kcal·cm–2，無霜期147～164 d，年降水量650～700 mm。土壤基礎理化性質為全氮（TN）1.6± 0.0 g·kg–1、全磷（TP）0.7±0.0 g·kg–1、全鉀（TK）10.0±0.2 g·kg–1、總有機碳（TOC）17.2±0.4 g·kg–1。

1.2 試驗設計

2019年于水稻試驗田中設置面積為1 m×1 m的微區，各微區隨機排列。試驗共設置2個處理：（1）周叢生物正常生長（WB）；（2）添加特丁凈（C10H19N5S）改變周叢生物生長處理（IB）。以上兩個處理各設置3個重復，共6個微區；此外，設置2個微區用于生物量的破壞性采集，整個實驗共設置8個微區。水稻品種采用當地品種，6月6日施用基肥（N肥144.0 kg·hm–2，P肥66.5 kg·hm–2，K肥 94.2 kg·hm–2），7月 11日施用分蘗肥（N 72.0 kg·hm–2），8月25日施用穗肥（N 24.0 kg·hm–2）。特丁凈（C10H19N5S）每次施肥后施加，施用量為10 mg·m–2。

1.3 樣品采集與理化性質分析

每次施肥后的第2天開始測定氨揮發，測定方法采用連續氣流密閉法[20]，以每天7：00～9：00 和15：00～17：00 的平均通量值代表日氨揮發通量，持續測定至無明顯氨揮發（7～10 d左右）。水稻生長全期（除施肥期）每10天采集一次周叢生物樣品，以及對應時期周叢生物生物量樣品。施肥期間每2天收集一次周叢生物樣品。使用刮鏟從稻田表面取出周叢生物，測定微生物組成。田面水采樣時間和頻率同周叢生物，采集完成后根據常規方法測定pH、TN、3NO-N-、4NH-N+ 含量[21]。pH 使用pH計（pHS-3C），TN 、3NO-N-、4NH-N+ 含量使用流動分析儀（Skalar San++System，荷蘭skalar儀器公司）測定。根據標準方法分析土壤性質[22]。總有機碳（TOC）和全氮（TN）含量分別由TOC分析儀（Vario TOC，德國Elementar）和元素分析儀（Vario MAX CN，Elementar，德國）測定，土樣經過酸消解后，根據Zhao的方法[23]，使用電感耦合等離子體發射光譜儀（Avio 200 ICP-OES，PerkinElmer，美國）分析了全磷（TP）和全鉀（TK）的含量。

試驗期間氣象信息列于表1。

1.4 微生物測序

取周叢生物樣品5～10 g，保存于無菌離心管中，液氮運回實驗室，置于–80℃保存。通過對（16S/18S）的PCR擴增產物進行高通量測序，分析周叢生物中微生物群落多樣性和分布規律，擴增子實驗分析如下：（1）DNA 提取：根據樣本對應的 DNA 提取試劑盒（FastDNA? Spin Kit For Soil，USA）進行基因組 DNA 抽提后，使用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的完整性和純度，NanoDrop One 檢測 DNA的濃度和純度；（2）PCR 擴增及產物電泳檢測：以基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶barcode的引物及Premix Taq（TaKaRa）進行 PCR 擴增，16S V4 區引物（515F 和 806R）以鑒定細菌多樣性，18S V4 區引物（528F 和 706R）以鑒定真核微生物多樣性；（3）Pooling 及切膠純化：使用 GeneTools Analysis Software（Version4.03.05.0，SynGene）對 PCR 產物進行濃度對比后，按照等質量原則計算各樣品所需體積，將各 PCR 產物進行混合，使用 E.Z.N.A. ? Gel Extraction Kit 凝膠回收試劑盒回收 PCR 混合產物，TE 緩沖液洗脫回收目標 DNA 片段。

擴增子實驗分析完成后，按照 NEBNext ? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina ? 標準流程進行建庫操作，使用 Illumina Hiseq 2500 平臺對構建的擴增子文庫進行 PE250 測序。原始測序數據處理流程如下：（1）Paired-end raw reads 數 據 過 濾 ：使用 Trimmomatic 軟 件V0.33分別對雙端的 Raw Reads 數據進行質量過濾，過濾含 N 的 reads、質量值低于 20 及過濾后序列長度低于 100bp的 reads。同時，根據序列首尾兩端的 barcode 和引物信息等，利用 Mothur 軟件V1.35.1將序列分配至相應的樣品中去除barcode和引物，得到質控后的paired-endclean reads；（2）Paired-end clean reads 拼接：對于雙端測序數據，根據 PE reads 之間的overlap 的關系，利用 FLASH V1.2.11軟件對每對 PE reads 進行拼接，將成對的 reads 拼成一條序列，最小 overlap 長度設置為10bp，拼接序列的 overlap區允許的最大錯配比率為 0.1，過濾不符合的 Tags，獲得原始的拼接序列（raw tags）；（3）Raw Tags 序列質量過濾：利用 Mothur 軟件對拼接后的序列進行質量控制及過濾，得到有效的拼接片段（Clean Tags）。

棗棉間作條件下，不同灌水量對棉花產量存在顯著影響(圖3)，適量供水和輕度水分脅迫下產量表現較好，充分供水次之，中度水分脅迫產量最低。M3W3處理產量較M3W1、M3W4分別高62. 5%和13. 9%，M3W2處理產量較M3W1、M3W4分別高55. 6%和9. 0%，M3W4處理產量較M3W1高42. 7%，M3W3處理產量與M3W2處理無顯著差異。

1.5 數據分析

氨氣揮發通量的計算：

式中，F為氨氣的揮發通量（以N計kg·hm–2·d–1）；C為氨吸收液回收液中 NH+4-N的濃度（mg·L–1）；V為稀硫酸吸收溶液的體積（mL）；r為密閉腔的半徑（m）；6 表示時間轉換因子。

氨揮發累計量計算：

式中，sumF為水稻全期氨揮發累積量（kg·hm–2）；nF為每天氨揮發量（kg·hm–2·d–1）；n為測定天數。

氨揮發損失率計算：

式中，lossF為水稻全期氨揮發損失率（%）；ureaM為水稻全期施加的尿素量（kg·hm–2）

使用Execl處理原始數據，SPSS 進行單因素方差分析（ANOVA）、多重比較和相關性分析，顯著性水平為0.05，Origin 和Rstudio進行繪圖。

2 結 果

2.1 周叢生物對氨揮發的影響

由圖1所示，在水稻不同生育期，尿素施用1～2 d內氨揮發通量達到最大值，后期逐漸減少。其中，對照處理中的基肥、分蘗肥、穗肥最大揮發量為8.5、3.6、0.2 kg·hm–2·d–1；使用C10H19N5S改變稻田周叢生物后，基肥施加期間，減少周叢生物生物量，可將氨揮發通量峰值由8.5降至5.1 kg·hm–2·d–1，降低了39.9%；而分蘗肥施加C10H19N5S，可將最大的氨揮發通量由3.6降低至2.0 kg·hm–2·d–1，降低了46%；穗肥添加后的氨揮發通量由 2.0降低至1.2 kg·hm–2·d–1，實驗組較對照組降低了40%。綜上，添加C10H19N5S改變稻田周叢生物的生長可顯著降低稻田氨揮發。

如表2所示，對照組基肥時期氨揮發總量為24.8 kg·hm–2，分蘗期為10.9 kg·hm–2，穗肥期為 0.2 kg·hm–2，整個水稻生長期的氨揮發總量為35.9 kg·hm–2，占總施氮肥量的14.9%；相比較而言，添加C10H19N5S調控周叢生物生長的處理組中不同時期的氨揮發量均受到明顯抑制，基肥期和分蘗肥期分別降低 17.6和 10.9 kg·hm–2，穗期降低0.1 kg·hm–2，累計排放量減少至13.9 kg·hm–2，施肥后的氨揮發損失率減少至5.8%。添加C10H19N5S改變了周叢生物，進而減少了稻田氨揮發。

表2 改變周叢生物對氨揮發累積量及氨揮發損失率的影響 Table 2 Effect of addition of C10H19N5S on accumulated ammonia volatilization and ammonia loss rate via volatilization

2.2 周叢生物對田面水理化性質的影響

稻田周叢生物在不同時期對田間水中氮含量也有一定影響。不同處理下的總體表現為施肥后水中氮含量增加，分蘗肥期最明顯，然后逐漸降低。從圖2中可以看出，添加C10H19N5S改變生物被膜可以顯著降低水中 NH+4-N， NO3--N和TN的含量，施肥后影響更大。施用基肥后，改變周叢生物的田間水中 NO3--N、 NH+4-N和TN的含量分別降低了30.7、9.9和104.4 mg·L–1，后期由于烤田的影響，田間水分減少，稻田周叢生物生物量減少，周叢生物對田間養分含量的影響降低。

從圖2中可以看出，添加C10H19N5S對水體pH變化有一定影響，尤其以基肥期較為顯著。基肥期間，添加C10H19N5S改變周叢生物處理下初期田面水pH較正常生長狀態下降低了0.5，在基肥施加的中后期田面水pH逐漸增大，最高達到8.2，較周叢生物正常生長狀態下田面水pH高出0.7。而在分蘗肥與穗肥期間，不同處理下的田面水pH差異不大。 從整體上來看，前期控制周叢生物生長一定程度上促進了pH，在添加C10H19N5S改變周叢生物后期的pH相對周叢生物正常生長有所降低。

2.3 C10H19N5S對周叢生物生物量的影響

周叢生物正常生長狀態下，生物量峰值達79.9 g·m–2，施肥后明顯增加，以基肥施加后最為顯著，分蘗肥施加后一周生物量逐漸降低，最低16.9 g·m–2。C10H19N5S的添加對周叢生物生物量有明顯的抑制作用（圖3），從基肥施加后的第2天開始，周叢生物的生物量最低達到19.7 g·m–2。分蘗肥施加期間，周叢生物的生物量整體有所增高，但是添加C10H19N5S的實驗組生物量仍較對照組（WB）低了1.7～5 g·m–2。穗肥添加期間，兩組處理下生物量在水稻全期中均最低，這是由水稻生長旺盛，水層和土壤層中光照不充足，同時隨著溫度的降低，周叢生物的生長受到這兩個關鍵因素的抑制從而減緩[20]。

2.4 C10H19N5S對稻田周叢生物微生物群落組成的影響

從圖4a可以看出，真核微生物群落結構中以淡色藻門Ochrophyta（8.1%～67.6%）、隱真菌門Cryptomycota（3.9%～54.8%）、線蟲動物Nematoda（0.6%～42.6%）為優勢微生物。在這三種優勢菌中，隱真菌門Cryptomycota在基肥施加后占比最高，而淡色藻門Ochrophyta在分蘗期和穗期有明顯增高。 C10H19N5S的添加對隱真菌門Cryptomycota有明顯的影響，在水稻生長全期降低了5.3%～30.3%，而淡色藻門Ochrophyta的豐度在不同時期均表現出先增高后降低的趨勢。在水稻分蘗前（6月10日—7月11日），C10H19N5S的添加對線蟲動物Nematoda促進作用顯著，最高增加了12.5%。

添加C10H19N5S的添加后不同時期周叢生物中的細菌群落結構豐度（圖4b）從整體上看以變形菌門 Proteobacteria（52.1%～23.7%）、擬桿菌門Bacteroidetes（58.1%～16.8%）、綠灣菌門Chloroflexi（14.6%～0.8%）、酸桿菌門Acidobacteria（11.0%～3.3%）為優勢菌種。基肥施加后期（6月10日）和分蘗肥施加前期（7月 11日），厚壁菌門Firmicutes豐度明顯增大至10.7%～14.4%。C10H19N5S添加后變形菌門 Proteobacteria豐度在分蘗期降低了0.7%～13.5%，擬桿菌門Bacteroidetes豐度在苗期降低了3.4%～6.2%。相反，綠灣菌門Chloroflexi和酸桿菌門Acidobacteria的豐度均明顯增加，最高增加了4.5%和1.3%。

2.5 周叢生物介導的氨揮發影響因子

將不同時期田間氨揮發與周叢生物影響下的田面水理化性質、周叢生物中的群落結構進行相關性分析，并篩選相關性較好的因子（P<0.1）作為能夠有效影響周叢生物介導的氨揮發過程的潛在因素。如圖5所示，不同時期，周叢生物的生物量與氨揮發呈顯著正相關（r=0.526，P=0.053），即氨揮發通量隨著周叢生物生物量的增加而增大。然而，周叢生物細菌門上僅芽孢單菌門Gemmatimonadetes的相對豐度與氨揮發通量顯著相關，占優勢的幾種細菌和真核微生物并無顯著相關，推測周叢生物中是稀有物種主導氨揮發。對于田面水中的理化性質，NH+4-N、 NO3--N、TN含量均與氨揮發有一定的相關性，其中 3NO-N- 極相關（P<0.01），對于各種地面氣象資料，風速是其中影響氨揮發的一個最重要因素。

將顯著相關的微生物以及理化因子作為自變量，不同處理瞬時氨揮發量作為因變量，建立多元線性逐步回歸分析，進行模型擬合，可以基于稻田周叢生物預測稻田氨揮發通量。根據表公式（4）可知：以 3NO-N-、平均風速（WIN）和周叢生物生物量（Biomass）作為輸入量而構建的模型，預測效果和穩定性較好，調整后R2達到0.860。

3 討 論

氨揮發是發生在稻田氣層、水層以及土壤層上的相對復雜的物理化學反應過程，主要是由尿素施入土壤后水解，形成碳酸銨，然后分解產生銨離子、氨氣、二氧化碳和氫氧根，一般在施肥后的7～10 d左右發生。本實驗中氨揮發通量在施肥后的2～4 d為峰值[25]，5 d后開始下降。已有研究表明施氮量的增加會提高田面水中pH以及 NH+4-N濃度，從而增加了稻田氨揮發損失以及水稻對氮素吸收[26-27]。施用氮肥后，田面水中的 NH+4-N以及pH均出現了短暫性升高，其后隨時間的延長逐漸降低。本研究施肥處理下，稻田氨揮發損失率達到14.9%，高于Ju 等[28]對中國北部稻田土壤的氨揮發損失率（11.6%）的研究。傳統的田間施肥方式會刺激稻田氨揮發的增長，同時由于稻田長期淹水狀態，黏土沉積在耕作層的下層減少了施肥后通過地下水滲漏流失的氮素，增加了通過水解產生的氨揮發損失[29-30]。

在添加特丁凈后，稻田不同時期的氨揮發量出現了明顯的降低，氨揮發損失率降低了9.1%，表明使用特丁凈調控周叢生物生長能夠顯著影響稻田氨揮發。C10H19N5S常作為田間除草劑，在除草的同時可以抑制藻類的光合作用，降低藻類濃度，短時間抑制田面水pH升高[31-32]，已有研究表明C10H19N5S在伴隨著脲酶抑制的使用效果顯著[33]。基于C10H19N5S對田間藻類以及pH的作用，以及對稻田中較小的毒性，本實驗選用低濃度的C10H19N5S改變周叢生物結構，降低周叢生物中的藻類活性，以減少藻類通過光合作用引法的氨揮發加速。從結果看，添加C10H19N5S后周叢生物中的生物量出現了降低，同時，在相關性分析中稻田周叢生物生物量與氨揮發也有顯著的正相關。C10H19N5S可以通過抑制光系統II（PSII）來干擾藻類的光合作用[34]，它與PSII的QB位點特異性結合，減少電子向質體醌庫的轉移[35]，抑制光合作用氧氣的釋放[36]。Brust等[37]研究表明C10H19N5S對附生藻類的抑制作用是周叢生物生物量減少的直接原因。與對照組（周叢生物正常生長）相比，添加C10H19N5S后周叢生物量減少，并且田面水 NH+4-N、 NO-3-N濃度降低，因此，實驗組和對照組氨揮發量的差異是由水體中氨揮發底物濃度的變化引起的。對周叢生物中的微生物群落結構進一步分析發現，添加C10H19N5S對擬桿菌門Bacteroidetes、變形菌門Proteobacteria等豐度有抑制作用，有研究表明這種嗜營養微生物在高氮環境下群落豐度更高，而低氮環境中綠灣菌門Chloroflexi和酸桿菌門Acidobacteria等貧營養微生物更易生存[38-39]。可見添加C10H19N5S降低周叢生物的整體生物量，使稻田水土界面保持在低氮水平，從而抑制氨揮發。

通過構建模型發現，相比于田面水 3NO-N- 含量和地面風速兩個因素，周叢生物的生物量變化對氨揮發有更大的影響作用，日氨揮發通量在周叢生物生物量減少的情況下減少，而田面水 NH+4-N濃度的降低是周叢生物影響氨揮發的直接原因。

4 結 論

田面水氮素含量、地面風速、周叢生物生物量是影響氨揮發通量的三個關鍵因子。其中周叢生物對稻田氨揮發有一定促進作用，添加C10H19N5S抑制周叢生物生長后可以降低田間9.1%的氨揮發損失率，但是這種抑制作用并不是通過降低田面水pH實現的，而是通過改變周叢生物的生物量及其微生物組成以及降低田面水中氮素含量產生作用，添加C10H19N5S能夠降低稻田周叢生物生物量，改變周叢生物微生物群落結構，抑制富營養化微生物（擬桿菌門Bacteroidetes、變形菌門Proteobacteria）的豐度，增加貧營養化微生物（酸桿菌門Acidobacteria）的豐度，進而以低成本、高效的技術降低氨揮發累積量，緩解稻田溫室氣體排放帶來的環境壓力。