黃土高原采煤沉陷對土壤微生物群落的影響*

馬 靜，盧永強，張 琦，李肖肖，肖 棟，陳 浮?

（1. 中國礦業大學低碳能源研究院，江蘇徐州 221008；2. 中國礦業大學環境與測繪學院，江蘇徐州 221116；3. 中國礦業大學煤炭資源與安全開采國家重點實驗室，江蘇徐州 221116）

中國50%煤炭產能位于生態脆弱的黃土高原，采礦造成地表形變、沉陷、裂縫、滑坡，加劇了水土流失、植被衰減、土壤退化和生物多樣性銳減等問題[1-3]。采煤每年損毀土地達4.88萬hm2，累積損毀土地超 800萬hm2。全域生態空間修復是新時代生態文明建設的重大任務之一，但如此大規模的修復僅靠人工是無法實現的。為此，激發礦山生態系統的自恢復能力倍受關注[4]。土壤理化特征、種子庫、微生物等多因素決定了生態系統的自恢復能力，其中微生物對生態恢復起著重要的催化作用[5]。半干旱受損礦山由于缺水、土壤貧瘠和環境污染等問題，如僅實施植被重建、地形改造、土壤改良等工程，而離開微生物參與，則生態恢復潛力受限，恢復效果和速率差[1-3]。因此，礦山生態修復必須重視土壤微生物演替、生態過程及其恢復潛力。

微生物是生態系統的關鍵組分，在全球生態修復、環境監測及污染治理、生物保護等方面具有重要的價值[6-7]。近幾年有關礦山土壤微生物的研究明顯增多，采煤擾動改變了土壤環境的立地條件，不可避免地造成微生物適應性下降，且微生物生物量亦呈下降態勢[8]。如，Chen等[9]發現，內蒙古錫林郭勒采煤活動造成了土壤微生物多樣性下降。煤礦開采帶來的土壤破壞，給微生物群落和相應的生態系統服務帶來不利影響[10]。Sun等[11]發現，土壤微生物在采煤礦區塌陷后減少。Ezeokoli等[12]發現叢枝菌根真菌群落隨著煤礦塌陷區復墾時間的增加而呈顯著變化。礦山復墾則偏向積極作用。一些學者開始關注土壤微生物群落變化與環境要素之間的關系。Dimitriu等[13]報道了采礦干擾后土壤細菌群落結構和多樣性的變化。此外，不同物種之間的相互作用通常形成復雜的生態網絡，它控制著菌群組裝，從而影響了群落結構與功能[14]。微生物菌屬之間相互作用對了解環境變化下微生物群落組裝的動力學至關重要。盡管從全球圖譜到特定環境微生物生態網絡日益受關注，但對采礦沉陷環境中土壤微生物的相互作用知之甚少[15]。

近十年高通量測序打開了微生物黑箱之門，但如何提取、分析與綜合海量信息一直是難點[16]。分子生態網絡方法利用測序數據可視化表達微生物種群復雜的潛在互作關系，探索不同生態過程、生態功能穩定性與復雜性及關鍵類群作用[17]。Zhou等[14]和Luo等[18]使用該方法研究了CO2水平升高和土豆連作環境下土壤細菌種群在網絡結構、互作關系、關鍵物種上聯系和差異。采礦作為高強度擾動，勢必影響土壤物質養分循環。探索微生物種群的互作關系、尋找適應沉陷環境的關鍵類群、厘清礦山微生物群落分布的主控因素，對重建礦山生態系統自恢復力至關重要[19]。為此，選取黃土高原東坪煤礦、大柳塔煤礦采礦沉陷區作為研究對象，利用高通量測序技術和生態網絡分析方法，探索在礦山干旱、貧瘠、污染等特定環境條件下土壤微生物的發育與適應狀況、微生物種群與環境之間互作及互饋機制，尋找對生態自恢復起關鍵作用的功能類群，為黃土高原生態恢復和綠色礦山建設服務。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

黃土高原聚集了中國50%煤炭生產能力，資源儲量豐富，開采歷史悠久，生態破壞嚴重。本研究區選取東坪煤礦和大柳塔煤礦，二者均為黃土高原典型的采礦沉陷區。東坪煤礦位于山西省陽泉市盂縣（113°15′E～113°18′E，38°01′N～38°03′N），屬于溫帶大陸性氣候，年均氣溫8.7℃，年均降水450.0～550.4 mm。1982年正式投產，多年采礦造成地表塌陷、裂縫縱橫，水土流失嚴重，土壤貧瘠，植被覆蓋下降，甚至形成裸地。大柳塔煤礦位于陜西省榆林 市 神 木 縣（110°12′E～110°23′E，39°13′N～39°22′N），屬于溫帶大陸性氣候，年均氣溫8.6℃，年均降水290.4～410.3 mm。1996年正式開采，地下采空區占比70%，長期開采造成地下水位下降，地表干砂層增厚，土壤含水率下降，灌木、草類大面積枯死。

1.2 樣品采集與分析

2018年 8月 15日—18日在東坪煤礦（Dongping，記為DP）和大柳塔煤礦（Daliuta，記為DLT）沉陷區分別采集了24個樣品。土壤水分（soil water content，SWC）、溫度（soil temperature，ST）采用便攜式溫度濕度儀（TR-6，廣東順科達，廣州）現場速測法測定。再五點采樣法采集0～10 cm表土混合樣500 g，使用無菌專用袋密封包裝，車載冰箱冷藏送回實驗室處理。一份新鮮土樣泡沫箱冷藏、密封后直接郵寄至上海派森諾測序，另一份土樣室內自然風干后剔除石礫、動植物殘體，磨碎過100目篩，測定土壤理化和酶活性質[20-21]。

土壤pH和電導率（electronic conductivity，EC）采用電位法（水∶土=1∶5）測定（DDS-307A，上海雷磁）。土壤機械組成和土壤黏粒占比（clay percent，CP）采用比重計法測定。土壤有機質（soil organic matter，SOM）采用重鉻酸鉀氧化—比色法測定，土壤有效磷（available phosphorus，AP）釆用碳酸氫銨浸提—鉬銻抗比色法測定，土壤速效鉀（available potassium，AK）釆用醋酸銨浸提—火焰光度計（TAS-990，北京普析）法測定，土壤銨態氮（ammonium nitrogen，AN）用氯化鉀浸提—紫外分光光度法測定，土壤硝態氮（nitrate-nitrogen，NN）用氯化鈣浸提—紫外分光光度法測定[20]。脫氫酶（dehydrogenase，DHG）活性采用氯化三苯基四氮唑法測定，脲酶（urease，URA）活性用苯酚鈉—次氯酸鈉比色法測定，蛋白酶（protease，PRO）活性用茚三酮比色法測定[21]。

1.3 DNA提取與純化及PCR擴增和高通量測序

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取48個土壤樣品的DNA，對16S rRNA的V4和V5區進行PCR擴增，引物為515F（5’-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3’）和 907R（CCGTCAATTCMTTTRA GTTT）；98℃預變性2 min，98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環，72℃延伸5 min，降溫至10℃，進行PCR擴增。再用2%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR擴增產物檢測，用凝膠回收試劑盒（Axygen，美國）對目標片段進行切膠回收。按照前述電泳定量結果，選取Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit熒光試劑，Microplate reader（FLx800，BioTek，美國）定量儀器，將PCR擴增回收產物進行熒光定量，對各樣本按等比混合。利用 Illumina公司（Illumina，美國）開發的文庫制備試劑盒制備測序文庫。構建好的合格文庫，使用HiSeq2500 PE2500（Illumina，美國）進行上機測序，具體委托上海派森諾測序。

1.4 分子生態網絡分析

選取 16S rRNA 測序數據使用 http：//ieg4.rccc.ou.edu/mena平臺構建和統計分析土壤微生物分子生態網絡，本研究共構建了4個網絡[14，17]。具體方法為：平行樣本中的 OTU（operational taxonomic unit，操作分類學單位）數加和大于等于120的OTU（前75%）按log10轉換，計算OTUs之間的皮爾森（Pearson）相關系數，并轉換為相似矩陣。選擇最優相似閾值，利用每對節點之間的連接強度構成鄰接矩陣，分析最近鄰間距分布特征值預測分子生態網絡。利用Cytocape 3.7.1軟件可視化處理分子生態網絡，一個網絡被分成多個模塊，每個模塊代表一個功能單位。利用模塊內連接度（Zi）與模塊間連接度（Pi）對網絡節點功能進行劃分。網絡節點代表微生物群落中的種群或環境因子，節點之間的連接線代表物種或者環境因子之間的相互關系。

1.5 數據統計與處理

基于galaxy平臺（http//：mem.rcees.ac.cn.8080/）計算阿爾法（Alpha）多樣性指數，并進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析、典范對應分析（canonical correspondence analysis，CCA）、曼特爾檢驗（Mantel Test）及熱圖分析。采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA，analysis of variance）；用Origin9.0軟件繪制土壤微生物群落在不同分類水平上的豐度圖。

2 結 果

2.1 采煤沉陷對土壤環境因子的影響

從圖1可以看出，采煤沉陷對土壤環境因子產生了顯著的影響，但不同的沉陷深度對土壤環境因子的影響程度不同，方向不一。DLT沉陷區土壤pH、土壤溫度隨沉陷深度變大，土壤有機質、含水率、溫度隨沉陷深度減小，土壤有機質、含水率、黏粒占比隨沉陷深度變大，但AN呈隨機分布。盡管DLT和DP均處黃土高原，但采煤沉陷造成的土壤環境 因子變化差異明顯。地形特征與植被覆蓋變化可能是重要因素，DLT屬內蒙草原，地形平坦，沉陷深處通常土壤沙化、植被退化、鹽度上升，沉陷淺處一般維持草或灌草；DP則為丘陵區，沉陷對其影響不明顯，但會造成坡面上部的拉伸、斷裂以及下部的擠壓。上部盡管沉陷深度小，但根系和水份受損嚴重，植被枯死。因此，DLT和DP土壤環境因子對采煤沉陷表現為不同的響應。

2.2 采煤沉陷對土壤微生物群落結構和組成的影響

本研究DP全部24個樣品共檢測到1 152 916條有效序列，每個樣品序列數量介于30 615～54 632條。DLT全部24個樣品共檢測到902 912條有效序列，每個樣品序列數量介于32 834～41 666，分布更為均勻。采用97%相似水平對測序獲得的OTU進行歸類劃分，土壤微生物Alpha多樣性計算結果見表1。超1指數顯示DP土壤微生物群落豐富度高于DLT，但香農（Shannon）指數接近，又說明兩處微生物群落結構多樣性幾乎相同。反辛普森（Inv_Simpson）指數、皮洛均勻度（Pielou_evenness）指數和辛普森均勻度（Simpson_evenness）指數的計算結果表明DLT土壤微生物群落均勻度高于DP。

表1 東坪和大柳塔煤礦采煤沉陷區土壤微生物Alpha多樣性指數 Table 1 Alpha diversity index of soil microorganisms in mining subsidence area of DP and DLT Coal Mine

DP和DLT各24個樣品中的微生物被歸類為34和39個細菌門，放線菌門（Actinobacteria）最為豐富，分別占25.6%和28.9%（圖2a、圖2b）。DP所有樣本中相對豐度大于1%的優勢菌門有10個，而DLT所有樣本中相對豐度大于1%的優勢菌門有8個。盡管二處土壤主要菌門相似，但豐度有明顯的不同。此外，DP較DLT多了2個優勢菌門，即硝化螺旋菌門（Nitrospira，2.2%）和藍細菌門（Cyanobacteria，1.7%）（圖2a）。為了進一步區分兩組樣品的差異，對相對豐度排名前15（TOP 15）的屬進行分析，結果顯示，DP所有樣本中相對豐度大于1%的屬有RB41（2.5%）、Solirubrobacter（1.9%）、Roseiflexus（1.8%）、Gaiella（1.4%）和Lysobacter（1.1%）（圖2c），而DLT所有樣本中相對豐度大于1%的屬有Nocardioides（3.3%）、RB41（2.9%）、Solirubrobacter（2.1%）和Roseiflexus（1.2%）（圖2d）。其他TOP 15菌屬的相對豐度也差異明顯。

2.3 采煤沉陷對土壤微生物分子生態網絡的影響

選取24個樣本序列中OTU數加和大于等于120作為輸入項，構建DP和DLT微生物分子生態網絡，具體參數見表2。R2>0.75且主要參數高于隨機網絡，表明網絡具有可靠性[18]。DP網絡的節點、連接線和平均連接度遠高于DLT，反映前者群落更為復雜。DP平均聚類系數、最大連接數、傳遞性指數遠高于DLT，說明各菌群間聯系更緊密、關系更復雜，傳遞性更強。但DP網絡測量效率、模塊屬性低于DLT，表明后者對抗外界變化的抗性更高，反應更快。

表2 東坪與大柳塔煤礦采煤塌陷區土壤微生物細菌群落的分子生態網絡拓撲參數 Table 2 Topological parameter of molecular ecological networks of bacterial communities in the DP and DLT Coal Mine

不同節點借助模塊內或模塊間連接性在網絡中發揮作用，為此可從模塊內連接度（Zi）和模塊間連接度（Pi）判斷一些類群或功能是否起決定作用。一般將Zi≥2.5或 Pi≥0.62的節點視為關鍵物種[14]。從圖3可以看出，大于97.4%的節點是外圍節點，DP含6個模塊樞紐節點，分別是OTU_9950和OTU_105680（綠彎菌門）、OTU_11725和OTU_18161（放線菌門）、OTU_97093（奇古菌門）以及OTU_84960（酸桿菌門）。DLT僅含2個模塊樞紐節點，分別是OTU_133539（變形菌門）和OTU_81764（放線菌門）。這8個OTU可能是兩處群落的關鍵物種，但無連接節點和網絡樞紐節點，說明無支配種。

分子生態網絡可視化圖顯示各物種之間的相互關系，DP網絡含7個模塊，OTU_84960（酸桿菌門）、 OTU_105680（綠彎菌門）、OTU_44932（芽單胞菌門）、OTU_111599（變形菌門）和OTU_122057（奇古菌門）具有最高的連接度，介于50～62，它們均屬于模塊3（圖4a）。可以推斷，模塊3應為DP網絡的關鍵模塊，而OTU_84960和OTU_105680 是關鍵物種。DLT網絡含5個模塊，最大的5個節點是OTU_133539（變形菌門）、OTU_74153（變形菌門）、OTU_16577（綠彎菌門）、OTU_25372和OTU_124598（放線菌門），連接度介于11～22，均屬于模塊1，OTU_133539是關鍵物種（圖4b）。此外，DP網絡各節點間正相關關系優勢明顯，說明該區土壤微生物為應對沉陷造成的養分貧瘠時趨向相互合作（圖4a）。DLT網絡中模塊減少，模塊間連接線也少。一些模塊內正相關關系優于負相關，說明該區微生物對抗外界干擾的抗性不斷增強，有助于提升土壤的自恢復潛力（圖4a）。

2.4 土壤微生物群落與環境因子的互作關系

將OTUs和土壤理化性質進行Mantel Test分析，結果顯示DP土壤微生物OTUs與SWC、AP、NN、AN及URA呈顯著性相關（P<0.05），DLT土壤微生物OTUs與pH、ST、SWC、CP、DHG及PRO呈顯著性相關（P<0.05）（表3）。土壤微生物OTUs 與多環境因子存在顯著性相關，且驅動微生物演替的主控因子組合明顯不同，說明礦山土壤微生物群落變化不是單一因子驅動的，受多重環境因子疊加作用驅動。

表3 東坪和大柳塔煤礦采煤沉陷區土壤微生物OTUs與環境因子曼特爾檢驗 Table 3 Mantel Test of soil microbial OTUs with environmental factors in the DP and DLT Coal Mine

為厘清土壤微生物演替的驅動力，將圖4a、圖4b中大于5個節點的模塊與環境因子作熱圖分析（圖5）。結果表明：DP網絡中模塊1、2、3與EC呈顯著正相關，模塊2與SWC呈顯著正相關，模塊6與AP呈顯著正相關，模塊1與NN呈顯著正相關，模塊1和3與AN呈顯著正相關，模塊6和7與DHG呈顯著正相關，模塊2和5與URA呈顯著正相關。pH與模塊2呈顯著負相關，SOM、AK和PRO與任何模塊均無顯著相關性（圖5a）。DLT網絡中模塊1與pH、ST呈顯著正相關，模塊2與ST呈顯著正相關，模塊1、2與SWC、CP呈顯著負相關，模塊5與NN呈顯著正相關，模塊3與PRO呈顯著正相關。DHG與模塊3呈顯著負相關（圖5b）。特征模塊中優勢物種通常是網絡的關鍵物種，不同模塊與環境因子之間的驅動關系解釋了微生物群落對環境變化的不同響應，結果也反證了前述OTUs與環境因子之間的相互關系。

3 討 論

3.1 土壤微生物群落對采煤沉陷環境的適應性

盡管DP和DLT微生物群落多樣性存在著一定的差異，但相對豐度最高的菌門幾乎完全一致，即放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）（圖2）。這說明沉陷已干擾土壤微生物區系發育，微生物不斷地調整自身的結構并對沉陷環境作普適性變化。放線菌門具有特征性絲狀形態，又有降解和利用有機物的潛在能力[22]，它更適應在礦山惡劣環境中生存。變形菌門具有多樣化的生物地理分布，富含能降解各種污染物的好氧菌以及促生氧化酶的菌群[23]。黃土高原礦區地表沉陷后上覆土壤普遍干燥，無法形成積水，裂縫、滑坡、拉伸加大了土體孔隙度，更利于好氧菌的發育，并成為優勢菌門。酸桿菌門在礦山土壤酸化生態過程起重要作用，并廣泛分布于各種惡劣的自然環境中[24]。部分綠彎菌門的微生物具有固碳生態功能，這種功能在采煤沉陷區貧瘠土壤中顯得尤為重要，亦有報道，當土壤變得更加缺氧時，綠彎菌門會增加[25]。這好像與變形菌門成為優勢菌門存在矛盾，事實上更說明了沉陷土壤的環境復雜性，丘陵沉陷的坡底或平原沉陷的谷底通常受擠壓，土體孔隙度減少，甚至形成季節性或間歇性積水。這有利于綠彎菌門的生存，并發育為相對豐度高的菌門。從微生物群落菌門組成和網絡模塊可以推測，土壤微生物群落依據礦山特定的環境作適應性變化，沉陷區地形特征和土地利用進一步修飾了土壤微生物區系的演替。

3.2 采煤沉陷區土壤微生物的關鍵類群

分子生態網絡分析可揭示土壤微生物菌屬間相互作用，如模塊化、小區域或無尺度。DP和DLT網絡中存在一些蜂窩特征，有效地促進不同物種間的溝通并提升對采礦干擾的響應能力。DP網絡較DLT復雜且連接更加緊密（表2、圖4），具備更高 的干擾耐受性[26]。DP和DLT網絡特征顯示微生物組間的相互作用以及所涉及的物種變化，尤其是優勢物種的變化（圖3和圖4）。DLT網絡復雜性更低，因此更易對生物地球化學功能產生負面影響，從而導致微生物群落呈不穩定或更脆弱的狀態。盡管DP和DLT均屬黃土高原，但二者的自然參數仍有差異，如降水、氣溫和土地利用。事實上在微生物群落結構與組成相似的條件下，不同的網絡復雜性差異也暗示除礦山環境要素外，自然參數也重要的影響因子，如DP微生物群落多樣性低于DLT（表1、圖2）。地理特性、土地利用可能以不同的方式影響著微生物群落多樣性和網絡關系，未來仍需進一步證實。

分子生態網絡分析也為探尋關鍵類群提供了便利，關鍵類群在微生物組中發揮重要作用，缺失或導致微生物結構和功能發生重大變化[15]。盡管先前研究報道了各種環境中的關鍵類群[6，22]，但有關受損礦山土壤關鍵類群的報道幾乎空白。本研究依據網絡參數識別了DP土壤微生物關鍵類群，連接線大于50的OTU_84960（酸桿菌門）等5個節點和OTU_105680（綠彎菌門）等6個模塊樞紐中優勢物種作為關鍵類群。雖然圖2c）顯示OTU_97093（奇古菌門）和OTU_44932（芽單胞菌門）的相對豐度并不高，但并不影響它們的重要作用，這表明相對豐度與關鍵功能之間缺乏有效的關聯[27]。OTU_44932所屬的芽單胞菌門被認為既可在有氧條件又可無氧條件下生長[28]，具備廣泛的適應性是它能夠成為采煤沉陷環境中關鍵類群的重要原因。OTU_97093屬于的奇古菌門是第一個被確定參與硝化作用的古細菌[29]，可以氧化極低濃度的銨以應對采礦沉陷導致的土壤養分貧瘠環境。連接線大于11的OTU_133539（變形菌門）等5個節點和OTU_81764（放線菌門）等2個模塊樞紐中優勢物種作為DLT網絡的關鍵類群，DLT的關鍵類群不同于DP，且較少。Ezeokoli等[30]研究露天煤礦沙化土壤微生物群落時未發現關鍵類群，盡管與本研究的發現有所不同，但均說明采礦擾動易損害微生物群落，并對土壤養分循環和生態系統可持續性產生負面作用。

3.3 采煤沉陷區土壤微生物群落與環境因子的互饋機制

模塊中OTUs的聯系反映微生物菌群間的相互作用，也表明對共同環境參數的響應。負載重要功能的OTUs通常隨環境變化改變在網絡中的角色，模塊成員、拓撲角色和系統發育提供有用的信息來識別關鍵OTU。因此，了解土壤微生物類群間的互作及環境適應性可為礦山生態恢復提供洞察力，尤其是對人為干擾的響應，具有重要意義[22，27]。土壤pH、水分含量、有機碳等環境因子對礦區生態恢復中土壤細菌群落結構和組成具有較大影響，Xiao等[31]研究認為土壤環境因子在不同程度上影響土壤微生物活性，且微生物在養分循環利用和土壤肥力中起著至關重要的作用；da Silva等[32]發現土壤微生物學特性在一定程度上影響微生物生物量碳和微生物的呼吸作用。微生物是礦山土壤質量提升、生物多樣性恢復的重要手段，因此，理解微生物重要功能群與土壤因子間的關系對礦山生態恢復至關重要。

本研究發現模塊、節點連通性與環境因子之間存在顯著相關性，如DP網絡中，分屬模塊1、2、3的是關鍵菌群OTU_18161（放線菌門）、OTU_97093（奇古菌門）、OTU_105680（綠彎菌門）和OTU_84960（酸桿菌門）與EC密切相關（表3、圖4和圖5），這可能與采礦干擾土壤壤中流導致浸出液水溶性鹽含量變化有關，從而影響微生物群落。Sun等[11]發現煤礦區土壤細菌分布主要受SOM、AK和AP的影響。DP網絡中模塊6與AP顯著相關（圖5a），這可能與模塊6中關鍵菌群OTU_11725（放線菌門）有關，磷是不可缺少的營養元素之一，受干擾微生物溶解一些難溶的磷酸鹽參與自身新陳代謝，從而影響AP含量。不同采礦活動會影響土壤微生物豐度、分類學多樣性和功能多樣性。pH在代謝和遺傳中非常重要，這與DLT模塊1中關鍵菌群OTU_133539（變形菌門）與pH的關系相似，說明外部環境變量影響不同微生物組之間的相互關系，且這種變化與土壤特性密切相關。土壤酶活性對采煤沉陷引起的土壤環境變化反應十分迅速，本研究發現DP網絡中模塊2、模塊5與URA顯著相關，DLT網絡模塊3則與DHG及PRO顯著相關（圖5b）。采煤沉陷擾動降低土壤含水量，影響土壤酶活性，長期無法修復將使土壤養分循環受阻[8-10]。

就相對豐度前50的OTU與土壤環境因子的網絡互作關系而言，DP網絡中環境因子SOM具有最高連接度，AN、DHG、AK次之，而DLT網絡中，具有較高連接度的環境因的排序依次為ST、SWC、CP、DHG（圖6）。這些高連接度環境因子與占支配 地位的放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門之間的連接也多，且不同的環境因子與OTU連接的相關關系不一。就網絡參數而言，DP網絡中屬于酸桿菌門的OTU_84960（Holophagae）的連接度最高，且與土壤SOC、AP、AK、DHG和PRO直接相連呈負相關，與AN直接相連呈正相關，關系密切。DLT網絡中OTU_44846（Aquabacterium）的連接度最高，且與土壤SWC、CP、DHG、AN和PRO直接相連且呈負相關，與ST直接相連呈正相關，關系密切。就環境適應性而言，Holophagae與Aquabacterium可視為沉陷土壤微生物群落優勢菌群，或可助力今后黃土高原礦區生態恢復。

4 結 論

采煤通常對礦山土地生態系統產生顛覆式破壞，沉陷、裂縫、滑坡和堆壓等高強度擾動勢必干擾土壤物質養分循環，從而影響國土空間生態修復。本研究利用高通量測序和分子生態網絡方法探索微生物類群間的互作關系，厘清礦山微生物群落分布的主控因素，尋找適應沉陷環境的關鍵功能群。沉陷環境對土壤微生物群落多樣性、結構和分布模式影響顯著，但放線菌門一直最為豐富。東坪煤礦分子生態網絡互作關系較大柳塔煤礦更復雜、網絡節點和連接數更多。一些關鍵類群，如放線菌門、綠彎菌門和奇古菌門與環境因子直接相連且關系密切。此外，為適應礦山土壤營養貧瘠，微生物種群間更偏向相互合作，其中Holophagae與Aquabacterium為優勢關鍵菌群，或可助力礦山生態修復。本研究為脆弱礦山生態系統生態修復提供了一種新思路，未來進一步加強功能網絡研究，豐富對自恢復機制的理解，為黃土高原生態恢復和綠色礦山建設服務。