化痰祛瘀法調控miR－17－5p防治動脈粥樣硬化的作用機制研究

王付啟，李文濤，王媛，秦合偉*

（1.駐馬店市中醫院，河南 駐馬店 463000；2.河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450000）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎，目前，西醫藥治療AS 的療效不甚理想［1］，中醫藥防治AS 取得了一定的成果，但作用機制尚不明確。新近發現微小RNA（microRNA，miRNA）在AS 形成中具有重要的作用，miR－17－5p能夠通過抑制血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）和極低密度脂蛋白受體（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）的表達，影響前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtillisin/kexin type 9，PCSK9）參與負調控VLDLR 的表達，緩解內膜增生、管腔狹窄，影響AS 的發生發展［2］。因此筆者推測中醫藥防治AS 的作用機制可能與調控miR－17－5p、靶向調控VLDLR 或靶向調控PCSK9 間接調控VLDLR 有關。鑒于前期化痰祛瘀法抗AS 的研究基礎［3］，本研究旨在進一步觀察化痰祛瘀法抗AS 的作用機制是否與靶向調控miR－17－5p、靶向調控VLDLR或靶向調控PCSK9 間接調控VLDLR，抑制血管炎性反應有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ApoE-/-小鼠60只，SPF級，8周齡，體質量（20±2）g，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016－0006；C57BL/6 小鼠15 只，體質量（20±2）g，雄性，購自南京大學－南京生物研究所，動物許可證號：SCXK（蘇）2015－0001；SD 大鼠60只，體質量（300±20）g，雄性，購自鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場，動物許可證號：SCXK（豫）2019－0002。所有動物飼養于河南中醫藥大學第二附屬醫院動物實驗中心，試驗單位使用動物許可證號：SCXK（豫）2016－0009；飼養環境溫度為（22±1）℃，濕度為60%～75%，12 h循環照明，動物自由攝食、飲水。人血管平滑肌細胞（VSMC）購自上海滬震生物科技有限公司。

本實驗設計方案經河南中醫藥大學第二附屬醫院動物實驗倫理委員會審核通過，符合安全性和公平性原則，實驗動物符合國家對醫學實驗動物的有關要求［4］，倫理審核批準標號：20190622。

1.2 藥物與試劑

本研究所用化痰祛瘀法藥物為血管軟化丸（組方：黃芪30 g，山楂20 g，萊菔子15 g，丹參、三七、陳皮各12 g，清半夏10 g，甘草6 g）。按照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算低、高2 個劑量分別為21.6、86.4 g/kg，分別相當于60 kg 成人臨床用量等效劑量的5.8、23.3 倍，醫院煎藥房按照要求制備生藥含量分別為0.864、3.456 g/mL的水煎液。

PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，批號：A8203－6）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司，批號：P0029）；VLDLR 抗體（英國Abcam 公司，批號：ab203271）；PCSK9 抗體（Bioss 公司，批號：bs－6060R）；脂質體2000 轉染試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號：1734976）；微小RNA－17－5p 抑制物（廣州銳博生物科技有限公司合成）；其他化學試劑均由河南中醫藥大學第二附屬醫院實驗中心提供。

1.3 動物造模與分組給藥

所有小鼠適應性飼養1 周。C57BL/6 小鼠給予全程普通飼料喂養，作為對照組；ApoE?/?小鼠隨機分為模型組、miR-17-5p inhibitor 組、化痰祛瘀法高劑量組（高劑量組）和化痰祛瘀法低劑量組（低劑量組）4 組，每組15 只，全程均給予高脂飼料（含脂肪21%、膽固醇0.15%）喂養。飼養8 周后每組隨機抽取1 只小鼠，檢視其主動脈壁可見明顯的斑塊形成則視為造模成功，造模成功后開始進行干預，連續干預8 周后取材進行檢測。

對照組C57BL/6 小鼠給予尾靜脈注射生理鹽水處理；模型組ApoE-/-小鼠給予尾靜脈注射生理鹽水處理；miR－17－5p inhibitor組ApoE-/-小鼠給予尾靜脈注射miR－17－5p 抑制劑，劑量為30 mg/（kg·d），每周1 次；高劑量組ApoE-/-小鼠采用中藥灌胃，劑量為86.4 g/（kg·d），每日1 次；低劑量組ApoE-/-小鼠采用中藥灌胃，劑量為21.6 g/（kg·d），每日1次。

1.4 標本采集和病理形態學觀察

藥物干預8 周后，頸椎脫臼法處死小鼠，沿主動脈瓣至髂動脈分支處剝離全長主動脈。選取近主動脈瓣附近主動脈壁，一部分固定于4%甲醛溶液中，用于HE 染色；一部分置于?80 ℃冰箱凍存，用于分子生物學等檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 ELISA 法測定外周血清中IL－6、IL－10 和TNF－α等炎癥因子水平

采集小鼠血漿，嚴格按照ELISA 試劑盒說明的操作方法檢測血清中TNF－α、IL－6 和IL－10水平。

1.5.2 RT－PCR 法檢測主動脈miR－17－5p、VLDLR和PCSK9基因表達水平

將小鼠主動脈組織稱取質量后，加入適量的Trizol，提取總RNA。逆轉錄，采用SYBR Green 進行qRTPCR 反應。反應參數：95 ℃30 s，1 個循環；95 ℃5 s，55 ℃10 s，40個循環［4］。樣本中目的基因的計算方法為2－ΔΔCT，GAPDH為內參。引物序列：miR－17－5p正向引物為5′－CCAGCCAAAGTGCTTACAGTGC－3′，反向引物為5′－GTGCAGGGTCCGAGGTATTC－3′；VLDLR正向引物為5′－CCCGTTCTACTCAGTGTATCCC－3′，反向引物為5′－CTGCCATCGTCACAGTCATCC－3′；PCSK9正向引物為5′－GCGTCGTGGTGATTGGATTG－3′，反向引物為5′－CAGGGGTGTTGTGGATGCT－3′；GAPDH正向引物為5′－AGTGTGACGATTAATCGCAAG－3′，反向引物為5′－ATCCACATCTCTCGTTGTGGC－3′。

1.5.3 Western Blot 法檢測細胞中VLDLR 和PCSK9蛋白的表達

將主動脈稱量后，提取蛋白，采用BCA 蛋白定量法，蛋白電泳，分離，轉膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，用相應的一抗（VLDLR 和PCSK9）分別按照1∶200和1∶500孵育，4 ℃過夜，洗滌后標記二抗（滴度1∶200）雜交。采用化學發光試劑盒檢測，使用Image Lab 4.1圖像分析軟件檢測VLDLR 和PCSK9 印跡條帶凈吸光度值，以β－actin 為內參照，結果以樣本灰度值/內參照灰度值表示［4］。

1.6 統計學方法

所有數據采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據處理，結果用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD法檢驗，方差不齊時采用Tamhanés 法檢驗，P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

動物造模鑒定時每組各處死1 只，飼養和給藥過程中各組小鼠因發生撕咬致死5 只，因灌胃致死2 只，由于個別數據明顯偏離樣本主體，采用偏度-峰度檢驗法判斷離群值后剔除3 只，各組小鼠進入統計的數量均為10只。

2.2 各組小鼠主動脈病理形態觀察

經HE 染色后，光學顯微鏡觀察發現，模型組小鼠主動脈管徑厚薄不均勻，內膜不光滑，管腔內可見明顯的條狀或片狀動脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊內可見淺染無定形物和鈣化顆粒物，部分動脈粥樣硬化斑塊截面積大于主動脈截面積。miR－17－5p inhibitor組、高劑量組、低劑量組小鼠主動脈管徑厚薄雖然不均勻，但主動脈各層結構清晰，血管細胞排列較整齊，AS 病變程度明顯輕于模型組。結果見圖1。

圖1 各組小鼠主動脈病理形態影響觀察（HE染色，×200）

2.3 各組小鼠外周血IL－6、IL－10 和TNF－α 水平比較

與對照組相比，模型組小鼠外周血清IL－6、IL－10 和TNF－α 水平均明顯較高，差異有統計學意義（P< 0.05）；與模型組相比，miR－17－5p inhibitor組、高劑量組、低劑量組小鼠外周血清中IL－6、IL－10和TNF－α 水平均明顯降低（P< 0.05），高劑量組、低劑量組小鼠之間各項血清指標比較差異無統計學意義（P> 0.05）。這表明miR－17－5p 與TNF－α、IL－6、IL－10 水平呈正相關，化痰祛瘀法能夠通過調控miR－17－5p 影響外周血清中IL－6、IL－10 和TNFα等血管炎癥因子水平。結果見表1。

表1 各組小鼠外周血IL－6、IL－10和TNF－α水平比較（±s，n=10，pg/mL）

表1 各組小鼠外周血IL－6、IL－10和TNF－α水平比較（±s，n=10，pg/mL）

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組miR－17－5p inhibitor組高劑量組低劑量組TNF－α 10.14±1.84 33.47±4.61△18.19±7.15*19.26±2.59*19.89±1.78*IL－6 20.14±4.53 65.47±9.36△48.47±6.32*51.26±12.27*52.89±7.15*IL－10 165.50±28.24 392.14±31.21△191.25±26.15*231.98±34.67*235.01±36.83*

2.4 各組小鼠主動脈miR－17－5p、VLDLR 和PCSK9 mRNA表達水平比較

與對照組相比，模型組小鼠主動脈miR－17－5p和VLDLR mRNA 表達水平均明顯較高（P< 0.05），PCSK9 mRNA 表達水平明顯較低（P<0.05）。與模型組相比，miR－17－5p inhibitor組、高劑量組、低劑量組小鼠主動脈miR－17－5p 和VLDLR mRNA 表達均明顯下調（P< 0.05），PCSK9 mRNA 表達水平明顯上調（P< 0.05）；高劑量組、低劑量組小鼠之間miR－17－5p、VLDLR 和PCSK9 mRNA 表達比較無統計學意義（P>0.05）。結果見表2。

表2 各組小鼠主動脈miR－17－5p、VLDLR和PCSK9 mRNA表達水平比較（±s，n=10）

表2 各組小鼠主動脈miR－17－5p、VLDLR和PCSK9 mRNA表達水平比較（±s，n=10）

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組miR－17－5p inhibitor組高劑量組低劑量組PCSK9 1.57±0.21 0.27±0.06△1.36±0.32*0.84±0.19*0.83±0.15*miR－17－5p 1.05±0.11 2.05±0.16△0.86±0.19*1.48±0.54*1.50±0.61*VLDLR 1.12±0.19 2.14±0.28△0.94±0.33*1.54±0.24*1.61±0.28*

2.5 各組小鼠主動脈VLDLR 和PCSK9的蛋白表達水平比較

與對照組相比，模型組小鼠主動脈VLDLR 蛋白表達明顯升高（P< 0.05），小鼠主動脈PCSK9 蛋白表達水平明顯降低（P< 0.05）。與模型組相比，miR－17－5p inhibitor 組、高劑量組、低劑量組小鼠主動脈VLDLR 蛋白表達均明顯降低（P< 0.05），主動脈PCSK9 蛋白表達水平均明顯升高（P< 0.05）；高劑量組、低劑量組小鼠之間VLDLR 和PCSK9 表達比較無統計學意義（P> 0.05）。結果見表3和圖2。

表3 各組小鼠主動脈VLDLR和PCSK9的蛋白表達水平比較（±s，n=10）

表3 各組小鼠主動脈VLDLR和PCSK9的蛋白表達水平比較（±s，n=10）

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別對照組模型組miR－17－5p inhibitor組高劑量組低劑量組PCSK9 1.13±0.18 1.06±0.17△2.32±0.45*1.84±0.26*1.77±0.33*VLDLR 1.06±0.12 2.14±0.24△0.95±0.36*1.53±0.26*1.63±0.26*

圖2 各組VSMC中VLDLR和PCSK9蛋白表達情況

3 討論

miRNA 在疾病診斷和治療中發揮了重要的作用，研究者發現miR－17－5p 參與了AS 的發生發展過程［5］。有研究發現，低密度脂蛋白受體（LDLR）通過結合并內吞LDL 調節膽固醇代謝。VLDLR 主要分布在心肌、骨骼肌以及脂肪組織中，參與脂質代謝調節，病理條件下，能夠促進甘油三酯在細胞中的沉積，影響泡沫細胞的形成，導致AS 的發生、發展［6］。研究發現，在粥樣斑塊存在下，通過高表達VLDLR，結合低脂飲食，能夠降低血漿中VLDL及低密度脂蛋白（LDL）水平，促進AS斑塊消退［7］。

研究發現，PCSK9 表達于多種細胞，通過影響VLDLR 的表達［8］，可增強肝臟LDLR 的溶酶體和內涵體降解，提高血清LDL－C水平［9］。有研究者通過轉染PCSK9 進入VSMC，發現降低了VSMC 細胞VLDLR 水平［10］。新近研究發現，AS 發病與miR－17－5p 表達呈正相關，與VLDLR 的表達呈負相關；miR－17－5p 能夠通過靶向調控VLDLR，直接抑制VSMC 細胞VLDLR表達，miR－17－5p 通過影響PCSK9 參與負調控VLDLR的表達，抑制AS的發生發展［3］。

高脂血癥可歸屬于“血濁”范疇，血濁可致痰、瘀、毒等病理產物產生，壅塞脈道，沉積管壁，形成AS。本課題組結合中醫基礎理論和臨床實踐，確定痰阻血瘀是AS 的主要證型。本研究所用化痰祛瘀法的藥物為中成藥血管軟化丸，該方中山楂消食導滯，為君藥；黃芪補氣健脾，半夏健脾燥濕化痰，三七和丹參活血化瘀，共為臣藥；萊菔子下氣消食除脹，陳皮理氣和中，共為佐藥；甘草健脾和中，調和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏消積化痰、活血化瘀之功［11］。

本課題組既往研究發現，化痰祛瘀法能夠降低血清炎性反應，調節血脂，抑制AS斑塊發展［12－13］。此外，化痰祛瘀法抗AS 作用機制可能與介導巨噬細胞極化效應，調控miRNA－467b 靶向LPL 調控巨噬細胞，減少炎癥因子分泌和巨噬細胞脂質蓄積有關［14－16］。化痰祛瘀法能夠通過調控miRNA－126，影響其下游GRS16、CXCL12、CXCR4、VCAM－1 等細胞炎性因子表達，參與VEC 損傷與修復，抑制AS 發生發展［3］。新近研究發現，化痰祛瘀法能夠通過靶向調控miR－181影響輸入蛋白α3/NF－κB 信號通路，降低炎性因子水平，減輕血管內皮損傷，抑制AS發生發展［4］。

鑒于miRNA－17－5p能夠通過抑制血管平滑肌細胞VLDLR表達，影響AS的發生發展［2］，本研究旨在通過化痰祛瘀法抗AS 的作用機制是否與靶向調控miR－17－5p，靶向調控VLDLR 或靶向調控PCSK9間接調控VLDLR，抑制血管炎性反應，進而揭示化痰祛瘀法防治AS的分子機制。

本研究結果發現，經過化痰祛瘀法干預后，miR－17－5p inhibitor 組、高劑量組、低劑量組小鼠外周血清中IL－6、IL－10 和TNF－α 水平明顯下調，主動脈中miR－17－5p 和VLDLR mRNA 表達水平均明顯降低，PCSK9 mRNA 表達水平明顯升高。化痰祛瘀法不同劑量組之間各項指標比較差異不明顯，不存在量效差異。病理學檢測也證實，化痰祛瘀法和miR－17－5p inhibitor 均能夠抑制AS 的發生發展。可見，化痰祛瘀法抗AS 的作用機制可能與靶向調控microRNA－17－5p，靶向調控VLDLR 或靶向調控PCSK9 間接調控VLDLR，抑制血管炎性反應，減輕血管內皮細胞損傷有關。