circ_0000144靶向miR-502-5p調控人視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖和凋亡及遷移侵襲

儲明慧，陳海銀，張曉力

?KEYWORDS:retinoblastoma; circ_0000144; miR-502-5p; proliferation; apoptosis; migration; invasion

0引言

視網膜母細胞瘤是一種眼內惡性腫瘤，最常影響5歲以下的嬰兒[1]。臨床上視網膜母細胞瘤患者的典型特征是白瞳和斜視，活產兒發病率約為1/20 000[2]。盡管在過去的幾十年中進行了廣泛的研究，但視網膜母細胞瘤仍然難以診斷和治愈，在發展中國家，相關的死亡率高達約70%[3]。因此，闡明發病機制的分子機制對于視網膜母細胞瘤的早期發現和靶向治療十分重要。環狀RNA(circular RNA，circRNA)是單鏈，共價閉合的RNA分子，在多種類型的癌癥(包括結直腸癌，肝細胞癌和胰腺癌)中表現出異常表達，可能成為各種癌癥類型的診斷或治療靶標[4-5]。屬于一類短非編碼RNA(19～22個核苷酸)的微小RNA(MicroRNA，miRNA)通過靶向影響細胞生理和疾病發展的多種分子來調控基因表達水平，在人類疾病中發揮重要作用[6]。研究表明，circ_0000144在胃癌組織和細胞中上調表達，敲低其表達可減緩胃癌細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲，加速細胞凋亡[7]。circ_0000144在膀胱癌組織中表達上調，下調其表達可抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲[8]。miR-502-5p在腎細胞癌組織中低表達，上調其表達可抑制腎細胞癌細胞的遷移和侵襲，circ_001842通過miR-502-5p參與腎細胞癌發病機制[9]。miR-502-5p在乳腺癌組織和細胞中下調表達，可抑制乳腺癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡[10]。但是，目前尚未探討circ_0000144和miR-502-5p在視網膜母細胞瘤組織中的表達概況，以及其在視網膜母細胞瘤Y79細胞中的生物學功能和機制。基于此，本研究旨在確定circ_0000144和miR-502-5p在視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖、凋亡、遷移侵襲中所起的作用，以增進對視網膜母細胞瘤發病機制的理解。

1材料和方法

人視網膜母細胞瘤細胞株Y79購自中國科學院細胞資源中心(上海)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養基、胎牛血清(fetal calf serum，FBS)購自美國Invitrogen，si-circ_0000144、si-NC、pcDNA、pcDNA-circ_0000144、miR-502-5p mimic、miR-502-5p inhibitor(anti-miR-502-5p)、mimic陰性對照miR-NC，inhibitor陰性對照anti-miR-NC購自上海GenePharma，M-MLV逆轉錄酶購自日本TaKaRa，SYBR Green assay試劑盒購自德國Roche，溴化噻唑藍四氮唑(thiazole blue tetrazolium bromide，MTT)購自美國Life Technologies，膜聯蛋白V(Annexin V)-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Becton Dickinson，RIPA緩沖液、二抗購自美國Cell Signaling Technology，二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific，ECL工作液購自南京Biochannel，熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國BioVision，兔單克隆細胞核相關抗原Ki-67(nuclear associated antigen Ki67，Ki-67)抗體、兔單克隆B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體、兔單克隆Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated x protein，Bax)抗體、兔單克隆基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)-2抗體、兔單克隆MMP-9抗體、兔單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購自美國Abcam公司。Multiscan MK3酶標儀購自美國Thermo Scientific，7500 PCR儀購自美國ABI，FACSCalbur流式細胞儀購自美國BD。

1.2方法

1.2.1實時定量聚合酶鏈反應檢測circ_0000144和miR-502-5p表達按照制造商的說明，用TRIzol提取視網膜母細胞瘤組織和瘤旁組織的總RNA，使用M-MLV逆轉錄酶將其合成為互補DNA(complementary DNA，cDNA)。使用SYBR Green試劑盒進行實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)。circ_0000144和miR-502-5p，GAPDH(用于circRNA歸一化)和U6(用于miRNA歸一化)的引物如下：circ_0000144有義：5’-GAGTGTTGGCCTGTCCTCAA-3’和反義5’-TTGTGCCCAGTTGCCTGTAT-3’；GAPDH有義：5’-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3’和反義：5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3’；miR-502-5p：5’-ATCCTTGCTATCTGGGTGCTA-3’和通用引物5’-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACATGGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCC(T)-3’；U6有義：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和反義5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。使用2-ΔΔCt相對定量方法評估circ_0000144和miR-502-5p相對表達水平，其中ΔCt=Ct(靶標)-Ct(GAPDH/U6)。

1.2.2細胞培養與分組處理Y79細胞在含10% FBS的RPMI 1640培養基中和37℃、5% CO2培養箱中常規培養。將對數期Y79細胞分為si-NC組(轉染si-NC)、si-circ_0000144組(轉染si-circ_0000144)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-502-5p組(轉染miR-502-5p mimic)、pcDNA組(轉染pcDNA)、pcDNA-circ_0000144組(轉染pcDNA-circ_0000144)、si-circ_0000144+anti-miR-NC組(轉染si-circ_0000144和anti-miR-NC)、si-circ_0000144+anti-miR-502-5p組(轉染si-circ_0000144和anti-miR-502-5p)。將Y79細胞以2×105細胞/孔的密度接種在6孔板中，匯合至60%時，利用Lipofectamine 2000試劑進行上述轉染。48h后，根據1.2.1中的qRT-PCR檢測步驟，測定circ_0000144和miR-502-5p表達，并進行后續檢測。

1.2.3MTT檢測細胞增殖將轉染48h后的Y79細胞接種到96孔板中，然后將細胞培養2d時，分別與100μL無菌MTT染料(0.5mg/mL)和150μL二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)孵育，15min后，于Multiscan MK3酶標儀測量490nm處的吸光度OD值。

1.2.4免疫印跡實驗測定蛋白表達用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液裂解轉染的Y79細胞，并根據制造商的說明使用二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度。然后將20μg蛋白質上樣到10%凝膠上，使用SDS-PAGE分離并轉膜。然后在室溫下將膜用5%無脂牛奶封閉2h。隨后，將膜與Ki-67、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9(均為1∶1 000)和GAPDH(參照，1∶2 500)的一抗一起孵育，在4℃過夜，與抗辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶2 000)室溫下孵育2h。通過ECL工作液觀察免疫反應帶。

1.2.5流式細胞術分析細胞凋亡將轉染48h后的Y79細胞用磷酸鹽緩沖液洗滌，重懸于500μL結合緩沖液中，在黑暗中添加5μL FITC和5μL碘化丙啶，并孵育15min。之后，通過FACSCalbur流式細胞儀測量Y79細胞凋亡。

1.2.6Transwell測定細胞遷移和侵襲分別使用24孔8μm的Transwell和Matrigel包被的Transwell進行遷移和侵襲分析。將約100μL Y79細胞溶液(包含5×105個細胞)鋪板到Transwell插入物的頂部腔室中，然后將600μL 10% FBS培養基添加到下部腔室中。24h后，將遷移或侵襲的細胞用70%乙醇固定，用1%結晶紫染色，并在光學顯微鏡(200×放大倍數)下在5個視野中計數細胞數。

采用 HPS、APP、SS、PCV2、B.subtilis、E.coli、Salmonella、S.aureu的DNA和CSFV的cDNA進行ddPCR特異性驗證。結果表明：除了HPS特異性擴增，其他檢測均為陰性，說明該方法特異性較好。

1.2.7生物信息學預測與雙熒光素酶報告實驗Circular RNA Interactome軟件預測circ_0000144與miR-502-5p存在互補配對的核苷酸序列。將circ_0000144和miR-502-5p的預測結合位點片段和突變片段分別插入各自的熒光素酶載體，即報告載體野生型(WT)-circ_0000144和突變型(MUT)-circ_0000144。為了確定二者的結合，將miR-NC、miR-502-5p mimic與WT-circ_0000144、MUT-circ_0000144一起轉染到Y79細胞中，48h后收集細胞并裂解，根據試劑盒說明書使用熒光素酶報告基因檢測試劑盒和分析系統進行測定。

2結果

2.1circ_0000144和miR-502-5p在視網膜母細胞瘤組織中的表達31例視網膜母細胞瘤組織中circ_0000144表達量高于瘤旁組織，miR-502-5p表達量低于瘤旁組織，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 circ_0000144和miR-502-5p在視網膜母細胞瘤組織中的表達

2.2抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖的影響如表2、圖1所示，si-circ_0000144組較si-NC組Y79細胞中circ_0000144表達量減少，OD值、Ki-67蛋白表達量降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖1 Ki-67蛋白表達。

表2 抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖的影響

2.3抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞凋亡的影響如表3、圖2所示，si-circ_0000144組Y79細胞凋亡率高于si-NC組，Bcl-2蛋白表達量低于si-NC組，Bax蛋白表達量高于si-NC組，差異均有統計學意義(P<0.01)。

表3 抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞凋亡的影響

圖2 抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞凋亡的影響 A：凋亡相關蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖。

2.4抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞遷移和侵襲的影響如表4、圖3所示，si-circ_0000144組Y79細胞的遷移、侵襲細胞數比si-NC組少，并且MMP-2、MMP-9蛋白表達量比si-NC組低，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖3 抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞遷移和侵襲的影響 A：遷移侵襲相關蛋白表達；B：視網膜母細胞瘤Y79細胞的遷移、侵襲(結晶紫染色)。

表4 抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞遷移和侵襲的影響

2.5circ_0000144靶向調控miR-502-5p的表達Circular RNA Interactome軟件預測出circ_0000144與miR-502-5p的靶向結合位點(圖4)。miR-502-5p組WT-circ_0000144熒光活性低于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.01)，miR-502-5p組MUT-circ_0000144熒光活性與miR-NC組差異無統計學意義(P>0.05，表5)。pcDNA-circ_0000144組(0.39±0.03)比pcDNA組(1.00±0.08)減少miR-502-5p表達量，si-circ_0000144組(3.01±0.22)比si-NC組(1.02±0.06)增加miR-502-5p表達量，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖4 circ_0000144的序列中含有與miR-502-5p互補的核苷酸序列。

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6miR-502-5p過表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響如表6、7，圖5、6所示，miR-502-5p組較miR-NC組增加Y79細胞miR-502-5p表達量、凋亡率，減少OD值、遷移及侵襲細胞數，以及降低Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達量，提高Bax蛋白表達量，差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖5 miR-502-5p過表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞凋亡、遷移和侵襲的影響 A：細胞凋亡流式圖；B：視網膜母細胞瘤Y79細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色)。

表6 miR-502-5p過表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

表7 miR-502-5p過表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響

圖6 增殖、凋亡、遷移侵襲相關蛋白表達。

2.7干擾miR-502-5p表達逆轉了抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用如表8、9，圖7、8所示，與si-circ_0000144+anti-miR-NC組比較，si-circ_0000144+anti-miR-502-5p組Y79細胞miR-502-5p表達量、凋亡率減少，OD值、遷移及侵襲細胞數增加，Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達量升高，Bax蛋白表達量降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖7 干擾miR-502-5p表達逆轉了抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞凋亡、遷移和侵襲的作用 A：細胞凋亡流式圖；B：視網膜母細胞瘤Y79細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色)。

表8 干擾miR-502-5p表達逆轉了抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的作用

表9 干擾miR-502-5p表達逆轉了抑制circ_0000144表達對視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關蛋白表達的作用

圖8 增殖、凋亡、遷移侵襲相關蛋白表達。

3討論

在目前的研究中，我們確定circ_0000144在視網膜母細胞瘤組織中上調。功能研究表明，siRNA對circ_0000144的下調減弱了視網膜母細胞瘤Y79細胞的增殖、遷移和侵襲特性，并加速細胞的凋亡。而增殖蛋白Ki-67、抗凋亡蛋白Bcl-2、轉移蛋白MMP-2、MMP-9的上調，以及促凋亡蛋白Bax的下調也證明了這一結果。在既往的報道中，hsa_circ_0000144的表達在胃癌細胞系中上調，可促進胃癌細胞的增殖，遷移和侵襲[11]。circ_0000144在甲狀腺癌組織和甲狀腺癌細胞系中的表達顯著升高，其高表達與患者的腫瘤大小、患者的腫瘤大小和淋巴結轉移顯著相關。敲除circ_0000144可抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[12]。這些與本研究的結果相吻合，證實了circ_0000144在體外可促進視網膜母細胞瘤細胞增殖和轉移，以及減少細胞凋亡，這為circ_0000144作為視網膜母細胞瘤致癌性circRNA提供了新的證據。

本研究qRT-PCR分析表明，miR-502-5p在視網膜母細胞瘤組織中顯著下調，表明其可能具有抑癌作用。然而miR-502-5p是否在視網膜母細胞瘤中起作用仍然未知。先前的研究表明，miR-502-5p與腫瘤的生長和轉移有關，例如You等[13]報道，與鄰近的正常組織相比，胃癌腫瘤組織中的miR-502-5p明顯下調，miR-502-5p的過表達在體外減弱了胃癌細胞的增殖，遷移/侵襲并誘導了G1期阻滯，并且抑制了體內腫瘤的生長和轉移。Ying等[14]揭示miR-502-5p在膀胱癌中被下調，miR-502-5p的過表達在體外抑制膀胱癌細胞增殖和遷移。Peng等[15]鑒定了胃癌組織和細胞中低表達的miR-502-5p，發現miR-502-5p通過靶向SP1來調節胃癌細胞的增殖，遷移和侵襲而充當抑癌基因。本研究觀察到，miR-502-5p過表達時，Y79細胞凋亡率、Bax蛋白表達量顯著增加，細胞增殖、遷移及侵襲能力、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達量則顯著減少。說明與既往報道[13-15]一致，miR-502-5p是視網膜母細胞瘤的腫瘤抑制劑，可以有效抑制視網膜母細胞瘤的發生發展。

越來越多的證據表明，某些circRNA可以通過充當miRNA海綿來調節miRNA，并在轉錄控制中發揮重要作用[16]。例如，胃癌中circ_0032627可以充當miR-502-5p的海綿[17]。肝細胞癌中circ-ZNF652可以海綿化miR-203[18]。本實驗中，Circular RNA Interactome軟件預測到circ_0000144與miR-502-5p的靶向結合，隨后的雙熒光素酶報告實驗證實circ_0000144靶向調控miR-502-5p的表達。且上調circ_0000144時，miR-502-5p表達被抑制，下調circ_0000144時，miR-502-5p表達被促進，說明circ_0000144可以負調控miR-502-5p的表達。干擾miR-502-5p表達后，抑制circ_0000144表達對Y79細胞增殖、遷移和侵襲、Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達的抑制作用被逆轉，其對細胞凋亡、Bax蛋白表達的促進作用也被逆轉。這些結果提示，circ_0000144通過負調控miR-502-5p參與視網膜母細胞瘤細胞惡性進展。

總之，本研究表明，circ_0000144在視網膜母細胞瘤組織中高表達，circ_0000144的抑制通過調節miR-502-5p來減輕視網膜母細胞瘤的進展。當前的研究強調了circ_0000144作為腫瘤啟動子在視網膜母細胞瘤中的潛在作用，因此circ_0000144是視網膜母細胞瘤治療的潛在靶點。