基于NF-κB通路研究清眩降壓湯對自發性高血壓大鼠的腎臟保護作用

陳達鑫，蔡巧燕，張 鈴，沈阿靈，褚劍鋒，朱正川，龍霖梓，熊曉滿，劉 菲，彭 軍，林 煒，林 珊*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122；3.福建中醫藥大學陳可冀學術思想傳承工作室，福建 福州350122；4.北京大學醫學部中醫藥臨床醫學院（西苑），北京100000；5.中國中醫科學院西苑醫院，北京100091）

原發性高血壓病（essential hypertension，EH）簡稱高血壓，是目前世界上最常見的心血管疾病之一［1-2］。慢性高血壓引發的心臟、腎臟、大腦等器官損害是高血壓致死的主要病因，高血壓腎病是原發性高血壓的重要并發癥，也是引起終末期腎病的常見病因之一［3-4］。統計資料表明，高血壓腎臟并發癥發病率為42%，其中有18%的患者最終會出現腎功能衰竭。腎臟損害在維持高血壓，損害其他靶器官中具有重要的誘發作用，是高血壓過程中最重要的病理改變［5-6］。高血壓的發展伴隨全身慢性炎癥，其中各類炎癥因子的增加會誘導炎癥通路如NF-κB的激活［7］。清眩降壓湯是陳可冀院士從臨床實踐中總結形成的治療原發性高血壓的經驗方，研究表明清眩降壓湯能明顯改善高血壓病患者的臨床癥狀和生存質量［8-9］。前期實驗研究也證實，清眩降壓湯在調控自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）收縮壓升高的同時也可以起到腎臟保護作用［8］。本研究在此基礎上，通過體內外實驗進一步研究清眩降壓湯對腎臟的保護作用及其可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與細胞4周齡清潔級SHR大鼠20只，Wistar大鼠10只，體質量190～200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0008。委托福建中醫藥大學實驗動物中心代購并飼養，許可證號：SYXK（閩）2014-0006。人腎小管內皮細胞NRK52E購自于中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 實驗藥物 清眩降壓湯藥物組成：苦丁茶30 g，天麻30 g，鉤藤30 g，黃芩10 g，川牛膝10 g，生杜仲10 g，夜交藤30 g，生地黃30 g，桑葉15 g，菊花15 g，均購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院。按照臨床給藥量換算為生藥量，采用水蒸氣回流法蒸煮，所得藥液減壓過濾后于蒸發皿內蒸干，真空干燥至粉末封裝于4℃備用，并用生理鹽水配制成灌胃藥液。

1.3 實驗試劑ELISA試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）；BCA試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）；Anti NF-κB p65、Anti phospho-NF-κB p65（美國CST公司）；GAPDH一抗、HRP二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；AngⅡ（美國Sigma公司），DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；PBS緩沖液、青霉素和鏈霉素（美國Hyclone公司）。

1.4 實驗儀器CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Infinite200 PRO多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；垂直電泳槽、ChemiDocXRS＋化學發光成像系統（美國BioRad公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組與干預 將20只4周齡SHR大鼠隨機分為SHR組和QXJYD組，每組10只，10只Wistar大鼠組成Wistar Kyoto（WKY）組作為正常對照。QXJYD組按5 g／（kg·d）予清眩降壓湯藥液灌胃，SHR組和WKY組給予等容積生理鹽水灌胃，每日給藥1次，持續給藥8周。

2.2 動物取材 干預8周后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉動物，腹主動脈取血后立即取左側腎臟，并立即置于液氮中；血液樣本于4℃下3 000 r／min離心5 min，收集血清；血清和腎臟均放置于-80℃冰箱保存。

2.3 ELISA法檢測血清中炎癥因子 根據試劑盒說明書步驟操作，于470 nm處分別檢測白介素－6（IL-6）、白 介 素-1β（IL-1β）及 腫 瘤 壞 死 因 子-α（TNF-α）的OD值，并計算其表達。

2.4 細胞培養及干預NRK52E細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基于37℃、5%CO2條件下培養；當細胞匯合至70%～80%時，更換無血清培養基進行同步培養，將細胞按照設計進行分組：Control組（空白組）、QXJYD 50 μg／mL組、QXJYD 100 μg／mL組、AngⅡ組（1×10-7mol／L）、AngⅡ＋QXJYD 50 μg／mL組、AngⅡ＋QXJYD 100 μg／mL組，干預24 h后收集細胞待檢測。

2.5 Western bolt檢測腎臟組織和NRK52E細胞中p65和p-p65蛋白表達 腎臟組織加入蛋白裂解液，使用組織研磨儀粉碎后，12 000 r／min離心20 min收集上清；NRK52E細胞干預12 h后，用預冷的PBS洗滌3次，收集細胞后加入蛋白裂解液，12 000 r／min離心20 min收集上清。使用BCA法進行蛋白定量，100℃金屬浴變性5 min后，使用10%SDS-PAGE進行凝膠電泳；在冰浴下使用PVDF膜進行轉膜；轉膜結束后，使用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h，使用p65（1∶1 000）、p-p65（1∶1 000）的一抗在4℃條 件下孵育過夜，TBST洗3次，5 min／次；用HRP二抗（Rabbit，1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗3次，5 min／次。最后用ECL試劑顯影成像。

2.6 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件處理。計量資料符合正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析，若方差齊，采用LSD法進行各組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Games-Howell法進行兩兩比較。

3 結 果

3.1 3 組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達比較 見圖1。

圖1 3組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達比較

3.2 QXJYD對SHR大鼠腎臟組織p65磷酸化的影響Western Blot結果顯示：與對照組比較，SHR組大鼠腎臟組織的NF-κB信號通路被激活；與SHR組比較，QXJYD干預可以顯著降低p65的磷酸化水平；3組之間總p65無顯著改變。見圖2。

圖2 QXJYD對SHR大鼠腎臟組織p65磷酸化的影響

3.3 QXJYD對AngⅡ誘導NRK52E細胞p65磷酸化的影響 與Control組比較，單獨QXJYD 50 μg／mL干預后NRK52E細胞p65磷酸化水平下調，而QXJYD 100 μg／mL無明顯差異；AngⅡ可以顯著激活NRK52E細胞中p65的磷酸化，QXJYD可下調AngⅡ刺激所引起p65的磷酸化水平升高。見圖3。

圖3 QXJYD對AngⅡ誘導NRK52E細胞p65磷酸化的影響

4 討 論

高血壓屬中醫“眩暈”“頭痛”等范疇，病機多屬本虛標實，與肝、心、腎密切相關，其前期以肝陽上亢證最為多見。中醫藥治療高血壓在病因病機和治療方面均積累了豐富的經驗，加之中藥復方具有多成分、多環節、多靶點的整體作用特點，使其在降低血壓，減少并發癥方面顯現出現代藥物所不具備的天然優勢［10］。清眩降壓湯是陳可冀院士60余載臨床治療高血壓的經驗處方，針對高血壓初期階段“肝陽上亢”的證候特點，選用苦丁茶、天麻、鉤藤、桑葉、菊花、黃芩、夜交藤、杜仲、生地黃、川牛膝等10味藥物配伍而成，該方以清熱為主，兼以滋補肝腎，共奏平肝陽、清肝熱、益肝腎之功，主要適用于肝腎陰虛、肝陽上亢或陰虛上亢證的初發Ⅰ級高血壓患者（與當代人群體質特點及患高血壓的證候特征相一致），療效確切。課題組前期研究證實清眩降壓湯對SHR大鼠有顯著的血壓調控作用，同時對心、腦、腎等靶器官的器質性損傷有較好的治療作用［11-12］。

繼發于高血壓的腎臟損害即高血壓性腎病，是高血壓病最重要的并發癥之一。高血壓病患者體內活性氧（ROS）和脂質過氧化產物（MDA）含量明顯增高［13-14］。同時，患者體內超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、硫氧還蛋白過氧化物酶（TPx）和過氧化氫酶（CAT）等活性降低［15-16］。通過在腎臟固有細胞中進行氧化應激反應，激活多種轉錄因子，如NF-κB，形成腎臟炎癥狀態［17］。本研究結果表明，SHR組大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量明顯升高，表明高血壓的發生發展伴隨著全身慢性炎癥的發生，而炎癥因子浸潤腎臟后參與氧化應激損傷，進一步加重腎臟炎癥。清眩降壓湯可顯著降低高血壓引起的促炎因子（IL-6、IL-1β及TNF-α）的表達升高。同時體內外實驗結果發現，高血壓會引起腎臟組織及細胞中p－p65的表達升高，該現象被清眩降壓湯干預所抑制，結果提示清眩降壓湯防治高血壓腎損害與其抑制NFκB信號通路的活化密切相關。

綜上所述，本研究證實了清眩降壓湯具有良好的腎臟保護作用，其主要途徑可能是通過調控NFκB通路，進而減輕腎臟炎癥。但其如何具體影響腎臟氧化應激損傷的機制，有待進一步探討。