基于UHPLC-Q Exactive軌道肼高分辨質譜分析八珍方化學成分

林慧敏，任強強，許 文，3，黃鳴清，3*

（1.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，福建 福州350108；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122；3.福建省中藥學重點實驗室，福建 福州350122）

八珍方為中醫傳統方劑，最早記載于明代陳實功《外科正宗》中，為清朝宮廷補益之成方，有健脾和胃、益氣生血、肥兒消疳等功能。本方主要由參苓白術散加減而成，方中黨參健脾益肺，養血生津；山楂配伍麥芽，行氣消食、化濁降脂；薏苡仁配伍白扁豆，利水滲濕、健脾止瀉；山藥、芡實和蓮子配伍，補脾養胃、益腎固精；茯苓配伍白術，健脾益氣、利水滲濕；蓮子配伍茯苓，亦有寧心安神的功效。組方配伍合理，平和溫補，不寒不熱，可治療因脾胃虛弱所致的食少難消、腹痛便溏、面黃肌瘦，具有補而不滯、燥而兼潤、補而不膩之特點［1］。臨床研究表明，該方對幼老體弱及病后體虛、脾胃虛弱的患者尤為有效［2］；可治療脾虛型小兒營養不良，具有補虛消積之功［3］；可改善食欲不振，胃納減少的兒童脾虛厭食癥狀［4-5］，亦可治療小兒疳積［6］。藥理研究表明，該方具有增強胃腸蠕動，調節胃酸pH值，促進膽汁分泌，增加抗疲勞及耐缺氧能力的作用［1］。

八珍方現代研究多集中于臨床及藥理研究，化學成分研究僅表明此方中含有較多的人體必需微量元素［4，7］，不足以達到對該復方進行綜合質量控制的目的。本實驗采用超高效液相色譜-四級桿／靜電場軌道阱高分辨質譜技術，通過與化學成分數據庫比對，根據對照品化合物質譜的碎片離子信息，并結合相關文獻報道的裂解規律，對八珍方中化學成分進行鑒定分析，為其藥效物質基礎闡明以及臨床應用提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1290超高效液相色譜儀（美國Agilent technologies公司）；BSA124S-CW型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；PS-60AL臺式超聲波清洗器（深圳市雷德邦電子有限公司）；JXFSTPRP-24型研磨儀（上海凈信科技有限公司）；Heraeus Fresco17離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Q Exactive Orbitrap高分辨質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；明澈D24 UV純水儀（美國Merck Millipore公司）。

1.2 試藥 甲醇、乙腈（LC-MS級，德國默克公司）；甲酸、乙酸銨（LC-MS級，德國默克公司）；水為超純水（Merck Millipore公司）；內標：L-2-氯苯丙氨酸（批號：103616-89-3，純度≥98%，上海恒柏生物科技有限公司）；對照品：阿魏酸、紫鉚素、兒茶素、鞣花酸、牡荊素、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、原兒茶醛、沒食子酸、咖啡酸、沒食子酸乙酯、芹菜素、千層紙素A、山奈酚、木犀草素、槲皮素、苔黑酚葡萄糖苷、1-咖啡?？鼘幩帷⑿戮G原酸、綠原酸、隱綠原酸、蔓荊子黃素、根皮苷、木犀草苷、槲皮苷、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、蘆丁、水仙苷購自成都曼思特生物科技有限公司，供定性鑒定用；八珍方中藥流浸膏來源于國藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜-質譜條件

2.1.1 UPLC分析色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；正離子模式：流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），負離子模式：流動相為5 mmol／L乙酸銨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序均為（0～1.0 min，1%B；1.0～8.0 min，1%B～99%B；8.0～10.0 min，99%B；10.0～10.1 min，99%B～1%B；10.1～12.0 min，1%B）；流速：0.5 mL／min；進樣量：1 μL。

2.1.2 質譜條件Q-Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜采用電噴霧離子源正、負離子兩種模式。噴涂電壓：3.8 kV（正離子模式）和3.1 kV（負離子模式），毛細管溫度：320℃，鞘氣流速（Arb）：45 psi，輔助氣體流量（Arb）：15 psi，一級質譜分辨率（Full ms resolution）：70 000，二級質譜（MS／MS）分辨率：17 500，質荷比窗口寬度（TopN）：3，碰撞能梯度（NCE模式）：20、40、60 eV，掃描速率：7 Hz。質譜測定數據采用全掃描模式采集，數據采集范圍m／z 70～1 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品：阿魏酸、紫鉚素、兒茶素、鞣花酸、牡荊素、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、原兒茶醛、沒食子酸、咖啡酸、沒食子酸乙酯、芹菜素、千層紙素A、山奈酚、木犀草素、槲皮素、苔黑酚葡萄糖苷、1-咖啡?？鼘幩帷⑿戮G原酸、綠原酸、隱綠原酸、蔓荊子黃素、根皮苷、木犀草苷、槲皮苷、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、蘆丁、水仙苷適量，加甲醇配置為10 μg／mL的對照品溶液供定性鑒別用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取八珍方中藥流浸膏1.0 mL，移至5 mL量瓶內，用50%甲醇水稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即樣品溶液。精密移取200 μL樣品溶液至EP管中，加入2 μL內標，渦旋混勻30 s；樣品在4℃以2 000 r／min離心15 min，將上清液轉移到進樣瓶中上機檢測。

2.3 八珍方中藥流浸膏化學成分的鑒定 八珍方中藥流浸膏供試品溶液在“2.1”項色譜-質譜條件下進行分析，UPLC-Q-Exactive四級桿軌道阱高分辨率質譜正負離子模式下的總離子流圖見圖1、圖2?；瘜W成分的鑒定方法：首先，根據供試品的高分辨率質譜總離子流色譜峰，提取化合物精確分子質量信息，運用Xcalibur 3.0軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）在質量偏差小于5 ppm的范圍內計算其可能的元素組成。其次，以一級質譜獲取的分子離子峰作為母離子，進行碰撞誘導解離（CID）二級質譜分析，獲得相應化合物的碎片離子。根據化合物的質譜裂解途徑，結合對照品和相關文獻的報道，最終鑒定化合物91個，其中33個化合物經與對照品比對確定，結果見表1。

圖1 八珍方中藥流浸膏樣品UHPLC-Q Exactive軌道肼高分辨質譜的正離子流圖

圖2 八珍方中藥流浸膏樣品UHPLC-Q Exactive軌道肼高分辨質譜的負離子流圖

2.3.1 有機酸和酚酸類 由表1可見，共鑒定有機酸和酚酸類11種。現以綠原酸為例，根據多級碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏酚酸類成分的質譜裂解規律。在所建立的化學成分數據庫中綠原酸的分子式為C16H18O9，通過Compass Isotope Pattern模擬軟件計算其負離子模式下精確分子質量為353.087 3［M-H］-。一級質譜在負離子模式下給出分子離子峰為m／z 353.087 7［M-H］-，質量偏差Error為1.18 ppm，故初步推測其為綠原酸或其異構體。

表1 八珍方中藥流浸膏化學成分鑒定

該分子離子峰進行碰撞誘導解離，獲得的二級碎片離子有m／z 191、179、173、161、135，根據其化學結構和二級碎片信息，推斷m／z 191離子碎片是由母離子m／z 353.087 7［M-H］-失去一個咖啡酰基所致，m／z 173離子碎片是由m／z 191進一步失去一分 子H2O所 致。m／z 179離 子 碎 片 由 母 離 子m／z 353.087 7［M-H］-失去一個奎寧酰基所致，而m／z161和m／z 135離子碎片是由m／z 179分別進一步失去一分子H2O和CO2所致。其質譜裂解途徑見圖3，并且其色譜保留時間、分子離子峰和二級質譜碎片與綠原酸對照品完全一致。綜上，該化合物結合對照品和文獻［21］進行比對，鑒定為綠原酸。

圖3 酚類裂解途徑（以綠原酸為例）

續表1

2.3.2 黃酮類 由表1可見，共鑒定黃酮類43種?，F以槲皮苷為例，根據多級碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏黃酮類成分的質譜裂解規律。在所建立的化學成分數據庫中槲皮苷的分子式為C21H20O11，通過Compass Isotope Pattern模擬軟件計算其負離子模式下精確分子質量為447.092 7［M-H］-。一級質譜在負離子模式下給出分子離子峰為m／z 447.093 6［M-H］-，質量偏差Error為2.01 ppm，故初步推測其為槲皮苷。

該分子離子峰進行碰撞誘導解離，獲得的二級碎片離子有m／z 301、300，根據其化學結構和二級碎片信息，推斷m／z 301離子碎片是由母離子m／z 447.093 6［M-H］-失去一分子鼠李糖基（-Rha）所致，m／z 300離子碎片是由m／z 301進一步失去一個氫原子所致。其質譜裂解途徑見圖4，并且其色譜保留時間、分子離子峰和二級質譜碎片與槲皮苷對照品完全一致。綜上，該化合物結合對照品和文獻［22］進行比對，鑒定為槲皮苷。

圖4 黃酮類裂解途徑（以槲皮苷為例）

2.3.3 炔類 由表1可見，共鑒定炔類成分4種?，F以黨參炔苷為例，根據多級碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏炔類成分的質譜裂解規律。在所建立的化學成分數據庫中黨參炔苷的分子式為C20H28O8，通過Compass Isotope Pattern模擬軟件計算其負離子模式下精確分子質量為441.176 1［M+HCOO］-。一級質譜在負離子模式下給出分子離子峰為m／z 441.176 6［M+HCOO］-，質量偏差Error為1.17 ppm，故初步推測其為黨參炔苷。

該分子離子峰進行碰撞誘導解離，獲得的二級碎片離子有m／z 305、215、185、159、179，根據其化學結構和二級碎片信息，推斷m／z 305離子碎片是由母離子m／z 441.1766［M+HCOO］-失去一個-C7H6基團所致。m／z 179離子碎片是由母離子m／z 441.176 6［M+HCOO］-氧己環母核上失去-C14H16O5基團所致。m／z 215離子碎片是由母離子失去氧己環母核-C6H12O6基團所致，而m／z 185和m／z 159離子碎片是由m／z 215分別進一步失去-CH2O和-C3H4O基團所致。其質譜裂解途徑見圖5，并且其色譜保留時間、分子離子峰和二級質譜碎片與綠原酸對照品完全一致。綜上，該化合物結合對照品和文獻［23］進行比對，鑒定為黨參炔苷。

圖5 炔類裂解途徑（以黨參炔苷為例）

2.3.4 三萜類 由表1可見，共鑒定三萜類成分3種。現以茯苓酸B為例，根據多級碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏三萜類成分的質譜裂解規律。在所建立的化學成分數據庫中茯苓酸B的分子式為C30H44O5，通過Compass Isotope Pattern模擬軟件計算其負離子模式下精確分子質量為483.311 0［M-H］-。一級質譜在負離子模式下給出分子離子峰為m／z 483.311 5［M-H］-，質量偏差Error為1.09 ppm，故初步推測其為茯苓酸B。

該分子離子峰進行碰撞誘導解離，獲得的二級碎片離子有m／z 465、409、365，根據其化學結構和二級碎片信息，推斷m／z 465離子碎片是由母離子m／z 483.311 5［M-H］-失去一分子H2O所致。m／z 409離子碎片由母離子m／z 483.311 5［M-H］-失去一個丙酸基-C3H6O2所致，而m／z 365離子碎片是由m／z 409進一步失去一分子CO2所致。其質譜裂解途徑見圖6。綜上，該化合物結合文獻［20］進行比對，鑒定為茯苓酸B。

圖6 三萜類裂解途徑（以茯苓酸B為例）

2.3.5生物堿類由表1可見，共鑒定生物堿類成分12種?，F以蓮心堿為例，根據多級碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏生物堿類成分的質譜裂解規律。在所建立的化學成分數據庫中蓮心堿的分子式為C37H42N2O6，通過Compass Isotope Pattern模擬軟件計算其正離子模式下精確分子質量為611.312 1［M+H］+。一級質譜在正離子模式下給出分子離子峰為m／z 611.310 2［M+H］+，質量偏差Error為-3.17 ppm，故初步推測其為蓮心堿。

該分子離子峰進行碰撞誘導解離，獲得的二級碎片離子有m／z 579、504、283、206、107，根據其化學結構和二級碎片信息，推斷m／z 579離子碎片是由母離子611.310 2［M+H］+失去一個-CH3OH基團所致。m／z 504和m／z 107離子碎片由母離子在對甲基苯酚位置裂解所致，而m／z 283和m／z 206離子碎片是由母離子分別在碳-氧鍵和碳-碳鍵處斷裂所致。其質譜裂解途徑見圖7。綜上，該化合物結合文獻［24］進行比對，鑒定為蓮心堿。

圖7 生物堿類裂解途徑（以蓮心堿為例）

2.3.6 內酯類 由表1可見，共鑒定內酯類成分7種。現以白術內酯Ⅱ為例，根據多級碎片信息，解析八珍方中藥流浸膏內酯類成分的質譜裂解規律。在所建立的化學成分數據庫中白術內酯Ⅱ的分子式為C15H20O2，通過Compass Isotope Pattern模擬軟件計算其正離子模式下精確分子質量為233.154 1［M+H］+。一級質譜在正離子模式下給出分子離子峰為m／z 233.153 5［M+H］+，質量偏差Error為-2.44 ppm，故初步推測其為白術內酯Ⅱ。

該分子離子峰進行碰撞誘導解離，獲得的二級碎片離子有m／z 187、159、145、131、105、91，根據其化學結構和二級碎片信息，推斷m／z 187峰為［M+H-CH2O2］+，m／z 159和m／z 145離子碎片是由m／z 187分別進一步失去-C2H4和-C3H6基團所致。m／z 187峰進一步失去-C4H8、-C2H2和-CH2基團，則獲取m／z 131、105和91的離子碎片，其質譜裂解途徑見圖8。綜上，該化合物結合文獻［20］進行比對，鑒定為白術內酯Ⅱ。

圖8 內酯類裂解途徑（以白術內酯Ⅱ為例）

3 討 論

Q Exactive MS系統具有高通量的掃描和多重檢測能力，尤為擅長目標定量實驗?？焖俳惶娴恼摌O掃描模式支持最復雜的分析方法，在節約實驗時間的同時，能得到高質量質譜圖和化合物精確分子量，為復雜體系提供高度可靠的定性和定量測試結果，已廣泛應用到藥物代謝組學、蛋白質組學、中藥化學成分分析以及毒理學等研究領域［25］。本試驗利用該法對八珍方中藥流浸膏中化學成分進行分離和鑒定，通過獲得色譜峰準分子離子，對八珍方中藥流浸膏進行了化學成分分析，12 min完成化合物的分離，鑒別出91種八珍方可能含有的化學成分，包括11種有機酸和酚酸類成分、43種黃酮類、4種炔類、3種三萜類、12種生物堿類和7種內酯類成分，其余包括內酰胺和氨基酸類等成分。其中炔類成分主要來自黨參，三萜類主要來自茯苓，生物堿類主要來自于蓮子，內酯類成分主要來自白術，黃酮類成分主要來自山楂和薏苡仁，所鑒別出的化合物能夠很好地表征八珍方的特征化學物質基礎。

本試驗利用UHPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS聯用技術，建立對八珍方中藥流浸膏化學成分快速有效的系統鑒定方法，對八珍方中化學成分進行全面、快速的分析，將為控制八珍方制劑質量及闡明其作用機制提供科學依據，并且為中藥及其復方的物質基礎研究提供一種快速、有效的分析方法。