大鼠腰椎間盤退變模型的建立及其形態學觀察

陳 莎，王詩忠，鄧德萬

（1.福建省立金山醫院，福建 福州350028；2.福建醫科大學，福建 福州350108；3.福建中醫藥大學附屬福鼎醫院，福建 福鼎355200）

下腰痛（low-back pain，LBP）是一種以后背、腰骶部疼痛為主要表現，可伴有下肢放射痛或麻木的臨床疾病。在成年人群中患病率可達12%，嚴重影響患者工作及生活［1］。1970年CROCK［2］提出椎間盤紊亂學說，研究證實椎間盤退變可誘發下腰痛，但其機制尚未明確［3］。理想的動物體內退變模型是研究椎間盤退變機制及有效治療手段的必要基礎，本文通過建立一種大鼠腰椎間盤退變模型，并進行形態學觀察，為相關研究提供動物模型依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級3月齡健康雄性SD大鼠16只，體質量250～300 g，由上海動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實驗試劑 蘇木素伊紅染色液（上海碧云天生物科技公司）；TUNEL試劑盒（美國Promega公司）。

1.3 實驗儀器 切片機、倒置顯微鏡（德國LeiCa公司）；激光共聚焦顯微鏡（日本Leiss公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制作 實驗大鼠適應性飼養1周后，按體質量進行編號，運用隨機數字表法將16只大鼠分為假手術組及模型組，每組8只。大鼠腰椎間盤退變模型的制作采用纖維環穿刺法［4-5］，并加以改進，術前16只大鼠禁食禁水12 h，稱重，計算10%水合氯醛用量（3 mL／kg），予腹腔注射麻醉。模型組進行造模手術，假手術組僅切開皮膚再縫合。造模手術操作：大鼠剃毛暴露腹部手術區，清潔后仰臥固定，消毒后鋪巾，于前正中線右側旁開0.5 cm處做一縱行切口，暴露腹后壁，保護好腸管及下腔靜脈，從脊柱附著點上，緩慢剝離腰大肌，暴露L3／L4、L4／L5、L5／L6椎間盤（髂嵴平對L5／L6椎間盤或L6椎體），取21G穿刺針平行于軟骨終板進針，穿刺深度約為2.3 mm。穿刺成功后，依序關腹、縫皮。每只大鼠術后放入單籠飼養，予青霉素5萬單位肌注，每日1次，連續3 d。術后注意大鼠進食情況及步態，有無傷口感染及尿潴留等。

2.2 取材2組大鼠同等條件喂養8周后，以過量10%水合氯醛腹腔注射處死大鼠，經后正中線切開皮膚、逐層分離，剝除椎旁肌肉韌帶，取下完整腰椎節段后，于冰面上快速取出L4／L5椎間盤組織，放入4%多聚甲醛中固定48 h，于37℃恒溫箱中以10%EDTA脫鈣30 d，包埋切片后予HE染色及TUNEL法進行形態學觀察。

2.3 HE染色法觀察椎間盤組織病理情況 將切片分別浸入蘇木精及伊紅中染色、水洗、烘干、封片后，于光鏡下觀察各切片組織形態學結構，并進行組織學分級評分［6］，該評分級別共三級，每一級的評分內容包含4項：纖維環結構、纖維環與髓核分界線、髓核中的基質及髓核中的細胞，滿足任意一項即計入1分；最低0分，最高12分。

2.4 TUNEL法檢測椎間盤組織凋亡情況 切片染色處理后，采用DeadEnd熒光測定TUNEL系統檢測細胞凋亡，于激光共聚焦顯微鏡（Leiss LSM710）下分析樣本，200倍高倍視野下觀察并拍照，鏡下細胞核由DAPI染為藍色，凋亡細胞呈綠色熒光。

2.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 椎間盤組織HE染色 假手術組椎間盤組織中髓核無明顯皺縮，網狀結構完整，與纖維環界限分明，纖維環結構完整、排列有序；模型組椎間盤組織中髓核皺縮、結構紊亂，髓核細胞腫脹，髓核纖維環之間界限不清，纖維環局部撕裂、排列紊亂，纖維環細胞出現腫脹。見圖1。

圖1 2組椎間盤組織HE染色圖（×25）

3.2 2 組椎間盤組織學分級評分 假手術組椎間盤組織學分級評分為（5.00±0.82）分，模型組為（11.25±0.96）分，2組比較差異有統計學意義（P＞0.05）。

3.3 TUNEL法檢測椎間盤組織凋亡情況 鏡下可見，細胞核為藍色熒光，TUNEL陽性細胞呈綠色熒光。假手術組僅見少量TUNEL陽性細胞表達，模型組TUNEL陽性細胞表達較假手術組明顯增多。見圖2。

圖2 2組椎間盤組織TUNEL染色圖（×200）

4 討 論

建立可靠的動物椎間盤退變模型，是研究椎間盤源性疼痛機制及其治療手段的基礎。目前已報道如鼠、兔、豬、羊、犬等動物均已建立椎間盤退變模型，造模手段主要有以下幾類：①改變脊柱生物力學，如利用加壓裝置［7］、剪除椎旁肌肉韌帶［8］等誘發退變；②造成椎間盤損傷，如纖維環切開、穿刺法［9］、髓 核抽 吸法［10］、髓核 內注 射 木 瓜凝乳蛋 白酶法［11］；③阻斷軟骨終板血供通路，減少椎間盤營養供應以誘導退變［12-13］；④自發退變模型，如通過敲除特定基因，造成椎間盤物質代謝異常以引起退變，或使用具有椎間盤自發退變特性的動物，如沙鼠［14］。以上幾類模型各有優勢，但生物力學改變模型需要特殊加壓裝置或較高的操作技巧，髓核損傷模型不利于后續形態學觀察及成分研究；終板損傷模型具有理論基礎，但相關研究結果提示其可重復性差、缺乏穩定性；自發退變模型最為接近自然退變過程，但造模周期長、成本高，故應用受限。本模型采用的纖維環穿刺法，模擬纖維環損傷后，髓核組織突出、脫水、變性等椎間盤退變過程。穿刺深度選擇2.3 mm，可達纖維環全層，退變程度較纖維環部分穿刺法（穿刺深度1.5 mm）更高，且在穿刺4周后即可觀察到退變表現［4］。

椎間盤退變與遺傳基因、營養缺乏、生物力學改變、炎癥反應及細胞凋亡等多種因素相關。其中細胞凋亡是機體為維持內環境的穩定，細胞自主進行的有序死亡，細胞凋亡所致的活性細胞數目減少、基質合成不足，可引發椎間盤正常結構破壞。有研究發現，人體退變椎間盤組織標本中，細胞凋亡現象超過半數［15］。TUNEL法是一種結合分子生物學及形態學的實驗方法，廣泛應用于凋亡細胞或凋亡小體的檢測中，能直觀準確地反映凋亡細胞的形態及位置。故本實驗采用該方法結合最常見的HE染色法，觀察驗證椎間盤退變模型，鏡下可見模型組椎間盤結構紊亂、纖維環與髓核界限模糊、TUNEL陽性細胞表達較假手術組明顯增多等退變表現。

綜上所述，本實驗建立了一種有效的椎間盤退變模型，其操作簡便、重復性好、創傷較小，術后8周可觀察到明顯退變，較為經濟，可作為椎間盤退變研究的模型基礎。