人腦膠質瘤組織中Spinophilin的表達及臨床意義

邢靖松，梁 東，克甜甜，張 琳，于如同，高尚鋒

膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統惡性腫瘤，呈浸潤性生長，易復發，5年生存率不足5%[1]。隨著分子病理學的發展，尋找與膠質瘤惡性進展相關的關鍵分子，評估其與膠質瘤患者預后的關系具有重要意義。Spinophilin又名PPP1R9B，最早在神經元樹突棘中被發現[2]，可以與多種跨膜蛋白結合，調控細胞胞外信號向胞內傳導的生物學過程[3]。現有研究表明，Spinophilin在肝癌[4]和乳腺癌[5]中發揮抑癌作用，然而其在人腦膠質瘤組織中的表達及臨床意義尚未見報道。本文旨在探討Spinophilin在腦膠質瘤組織中的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2016年2月～2018年2月徐州醫科大學附屬醫院神經外科行手術治療的膠質瘤標本，標本均取自瘤中央，無出血、壞死、囊變，且未予電凝。所有膠質瘤患者均為原發，術前均未行任何抗腫瘤治療。非瘤腦組織標本取自同一時期顱腦外傷患者通過內減壓術切除的新鮮腦組織。共收集冷凍標本42例(非瘤腦組織9例，膠質瘤組織33例)，所有標本提取了總蛋白用于Western blot檢測，6例非瘤腦組織和26例膠質瘤組織提取了總RNA用于qRT-PCR檢測；石蠟標本29例，其中非瘤腦組織7例，膠質瘤組織22例。患者性別、年齡、WHO級別、IDH分型等均從臨床病歷記錄中獲得。本實驗獲患者及家屬知情同意，徐州醫科大學醫學倫理委員會批準。

1.2 qRT-PCR檢測TRNzol試劑提取組織總RNA，Nano Drop分光光度計和瓊脂糖電泳測定RNA濃度及純度。Takara公司反轉錄試劑盒生成cDNA，反應條件：55 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min后置于4 ℃。以cDNA為模板，加入SYBR-Green染料復合物、Spinophilin上游引物5′-GCCCAGCTAATTCAG CAGAC-3′和下游引物5′-GGAGCTCCTTGAACTTGT GC-3′，在ABI 7500 PCR反應儀上進行PCR擴增，反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個循環。以β-actin作為內參，對Spinophilin核酸表達量進行定量分析。

1.3 免疫組化石蠟切片脫蠟、水化，在檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中進行抗原修復，滴加Spinophilin一抗(1 ∶200稀釋，AB5669，Millipore公司)，室溫孵育1 h后4 ℃過夜，次日按Vector公司ABC試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木精復染，切片脫水、透明、封片，顯微鏡下拍照，Image J軟件分析細胞核總數和Spinophilin陽染細胞數，計算Spinophilin陽性細胞百分比。

1.4 Western blot檢測組織標本勻漿后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量組織樣品總蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉膜、封閉后，按1 ∶10 000加入Spinophilin多克隆抗體(Millipore公司)和β-actin單克隆抗體(sc-47778，1 ∶1 500稀釋，Santa cruz公司)，4 ℃孵育過夜，次日加入二抗(1 ∶4 000稀釋)，室溫孵育2 h，滴加ECL化學發光液，在Bio-Rad化學發光成像系統拍照，使用Image J軟件進行灰度掃描，以β-actin作為內參計算Spinophilin的相對蛋白表達量。

1.5 生物信息學分析本組涉及的公共膠質瘤數據集來自于以下網站：CGGA中國腦膠質瘤基因組圖譜計劃(http://www.cgga.org.cn/index.jsp)、TCGA美國腫瘤基因組圖譜數據(https:// cancergenome.nih.gov)、GSEl6011和GSE4290 mRNA芯片數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc)，利用R2(https://hgserver1.amc.nl)和GEPIA兩個在線工具分析上述數據集，獲得Spinophilin基因表達差異和Kaplan-Meier生存曲線圖。

1.6 統計學方法采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，采用Kruskal-Wallis檢驗和Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05表述差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Spinophilin基因在不同級別膠質瘤組織中的表達變化在TCGA膠質瘤數據集中，與非瘤腦組織相比，Spinophilin在低級別膠質瘤及膠質母細胞瘤中的表達量均降低，在膠質母細胞瘤中的表達差異有統計學意義(P<0.05，圖1A、B)。在GSE16011和GSE4290膠質瘤數據集中，與非瘤腦組織相比，Spinophilin在WHO Ⅲ級(P<0.01)和Ⅳ級(P<0.001)膠質瘤中低表達(圖1C、D)。應用qRT-PCR檢測本組26例膠質瘤樣本也發現，Spinophilin mRNA在WHO Ⅱ～Ⅳ級膠質瘤中表達量均有所下降，在WHO Ⅳ級中的表達差異有統計學意義(P<0.05，圖1E)。

圖1 A.TCGA低級別腦膠質瘤數據集中Spinophilin表達：非瘤腦組織207例，腫瘤組織518例；B.TCGA膠質母細胞瘤數據集中Spinophilin表達：非瘤腦組織207例，腫瘤組織163例；C.GSE16011膠質瘤數據集中Spinophilin表達：非瘤腦組織8例，膠質瘤WHO Ⅱ級24例，Ⅲ級85例，Ⅳ級159例；D.GSE4290膠質瘤中Spinophilin表達：非瘤腦組織27例；膠質瘤WHO Ⅱ級45例，Ⅲ級31例，Ⅳ級77例；E.本組膠質瘤中Spinophilin表達：非瘤腦組織6例，膠質瘤WHO Ⅱ級10例，Ⅲ級8例，Ⅳ級8例；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

2.2 不同IDH分型膠質瘤中Spinophilin基因的表達在GSE16011膠質瘤數據集中，Spinophilin在IDH1野生型膠質瘤組織中表達低于IDH1突變型，差異有統計學意義(P<0.05，圖2A)；CGGA數據集中與該結果類似(P<0.001，圖2B)。本組33例膠質瘤冷凍樣本中具有明確IDH1狀態的病例17例，qRT-PCR檢測亦證實，Spinophilin mRNA在IDH1野生型膠質瘤中的表達低于IDH1突變型(P=0.10，圖2C)。

圖2 不同IDH分型膠質瘤中Spinophilin的表達：A.GSE16011膠質瘤數據集中Spinophilin表達，IDH突變型83例，IDH野生型143例；B.CGGA膠質瘤數據集中Spinophilin表達，IDH突變型356例；IDH野生型286例；C.本組膠質瘤中Spinophilin的表達，IDH1突變型10例，IDH1野生型7例；*P<0.05，***P<0.001

2.3 不同級別膠質瘤中Spinophilin蛋白的表達免疫組化檢測Spinophilin蛋白陽性主要定位于細胞質(圖3A)，與非腫瘤腦組織相比，Spinophilin陽性細胞百分比在不同級別膠質瘤組織中均有所下調，在WHO Ⅱ級(P<0.01)、Ⅲ級(P<0.01)中差異均具有統計學意義(圖3B)。Western blot檢測結果顯示，與非瘤腦組織相比，Spinophilin蛋白在膠質瘤組織中的表達下降，在WHO Ⅳ級膠質瘤組織中的表達差異有統計學意義(P<0.01，圖4)。

2.4 Spinophilin表達與膠質瘤患者預后的關系在CGGA膠質瘤數據集分析發現(圖5)，Spinophilin高表達預示著膠質瘤患者預后較好，其高表達與較好的預后主要存在于WHO Ⅱ級(P=0.041)和Ⅲ級(P=0.033)膠質瘤，而不是WHO Ⅳ級膠質瘤(P=0.39)。

圖5 CGGA數據集分析Spinophilin與膠質瘤患者預后的關系：A.WHO Ⅱ～Ⅳ級膠質瘤中Spinophilin高表達組的總生存時間顯著長于低表達組，n=409；B.WHO Ⅱ級膠質瘤中Spinophilin高表達與較長的總生存時間顯著相關，n=133；C.WHO Ⅲ級膠質瘤中Spinophilin高表達與較長的總生存時間顯著相關，n=141；D.在WHO Ⅳ級膠質瘤中Spinophilin表達與生存期無關，n=135

3 討論

蛋白磷酸酶與蛋白激酶共同調節底物的磷酸化，在腫瘤細胞增殖和浸潤中發揮重要作用[6]。Spinophilin最早被視作一種與磷酸酶PP1結合的蛋白質[7]，近年研究發現，其在肝癌、乳腺癌等腫瘤組織中低表達[4,8]。本組亦發現，膠質瘤中Spinophilin mRNA和蛋白均低表達，并與患者較短的生存期相關。此外，在肺癌特別是鱗狀細胞癌中，Spinophilin下調與患者不良預后密切相關[9]。因此，Spinophilin可能是一個重要的腫瘤抑制蛋白。

文獻報道在肝癌細胞中下調Spinophilin，可增加Cyclin D2的表達，促進細胞增殖[4]。在乳腺癌細胞中，下調Spinophilin可增加腫瘤細胞干細胞特性，提高乳腺癌細胞侵襲能力[10]。低表達Spinophilin的膠質母細胞瘤細胞顯示出，Rac1活性降低、侵襲偽足數量增加和細胞外基質降解增強；實驗還證實，過表達Spinophilin可抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲[11]。Spinophilin作為肌動蛋白的結合蛋白，與細胞運動密切相關[12]，其在調控腫瘤細胞侵襲中的作用及機制有待進一步研究。此外，Spinophilin低表達或缺失在肺癌和結直腸癌中常伴隨TP53基因突變，兩者可能在腫瘤發生上存在一定的協同作用[13]，具體機制有待進一步分析。

綜上所述，本組通過大樣本數據分析和小樣本實驗驗證發現，Spinophilin在腦膠質瘤中低表達，與患者較差的預后相關。Spinophilin有望成為膠質瘤分子病理診斷的生物標志物和抗膠質瘤藥物研發的新靶點。但本課題中納入臨床樣本量有限，導致本組部分實驗結果與公共數據庫數據存在一定偏倚。