子宮頸鱗狀細胞癌中SIAH2蛋白表達的臨床意義

甄 娟，劉玉東，吳 莎，宋春紅，畢學杰

目前子宮頸鱗狀細胞癌的預防和治療方案已較為完善，然而近年來子宮頸癌發病趨勢逐漸年輕化，且仍有50%以上病例發現時已為晚期，患者出現全身衰竭癥狀，嚴重影響其生活質量和生存率，因此早期篩查和早期發現危險因素對于改善晚期子宮頸鱗狀細胞癌患者的預后至關重要[1-3]。已有大量研究及臨床實驗從基因、分子等方面入手，以改善患者生活質量及延長患者生存期為治療目標，尋找更有前途的治療途徑。研究發現，E3泛素連接酶SIAH2在有增殖能力的正常細胞和腫瘤細胞中表達，在不增殖的細胞中表達缺失，SIAH2作為一種重要的腫瘤因子，在惡性腫瘤的發生進展中發揮重要作用[4]。然而，SIAH2在子宮頸鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義尚未見報道。本實驗旨在探討SIAH2在子宮頸鱗狀細胞癌癌變過程中的表達及其與臨床病理特征的關系，并分析SIAH2與患者預后的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年12月～2019年12月間石家莊市第四醫院婦科陰道鏡活檢和手術切除的子宮頸組織標本220例，其中癌旁正常子宮頸組織40例，高級別鱗狀上皮內病變60例，子宮頸鱗狀細胞癌120例，所有患者術前均未接受放、化療及其他治療。標本均經石蠟包埋及HE染色，分別由兩名病理醫師根據WHO(2014)子宮頸腫瘤分類標準和FIGO(2018)分期系統確定腫瘤的組織學分級以及病理分期。術中同時留取36對子宮頸鱗狀細胞癌及癌旁子宮頸組織(經形態學證實為正常子宮頸組織，無病變殘留)，組織離體后取少量立即放入液氮后移入-80 ℃冰箱保存，以備RT-qPCR和Western blot檢測。所有標本的使用均通過了本院倫理委員會審核，患者均知情同意。

1.2 主要試劑SP試劑盒(KIT9710)、DAB顯色試劑、PBS緩沖液均購自福州邁新公司，FastQuant RT Kit試劑盒購自天根生化科技公司，GO Taq qPCR Master Mix試劑盒購自Promega公司，PCR引物合成委托生工生物工程(上海)公司進行。鼠抗人SIAH2抗體(sc81787)購自美國Santa Cruz公司，β-actin抗體購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 采用免疫組化SP法染色。所有組織均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯、水化，高溫高壓抗原修復，按SP試劑盒說明書進行染色，SIAH2(抗體濃度1 ∶200)，用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。結果判定：染色結果由兩名有經驗的中級以上病理科醫師閱片審核，SIAH2蛋白在細胞核中出現棕黃色顆粒為陽性。每張切片在腫瘤實質區域選取5個高倍視野(400×)，每個視野計數200個瘤細胞。按陽性細胞百分比計分：無陽性細胞計0分，陽性細胞≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，>80%計4分。按細胞著色強度計分：無陽性著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，黃褐色計3分。將上述兩項計分相乘：<3分為陰性，≥3分為陽性[5]。

1.3.2RT-qPCR 采用RT-qPCR法，用Trizol試劑提取36對子宮頸鱗狀細胞癌及癌旁正常子宮頸組織總RNA，利用FastQuant RT Kit試劑盒反轉錄獲得cDNA，在ABI 7500上利用GO Taq qPCR Master Mix試劑盒進行RT-qPCR分析。SIAH2上游引物：5′-AGCATCAGGAACCTGGCTAT-3′；下游引物：5′-CTGGTTTCTCCGTATGGTGC-3′。內參18S上游引物：5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3′；下游引物：5′-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3′。

1.3.3Western blot法 采用Western blot法，收集36對新鮮子宮頸組織，加入裂解液，粉碎勻漿后，低溫高速離心(4 ℃，12 000 r/min，40 min)，提取上清液為總蛋白，Bradford法測定細胞提取物的蛋白濃度。聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳、恒壓轉印，脫脂奶粉封閉，抗SIAH2(1 ∶150)、抗β-actin(1 ∶200)4 ℃孵育過夜，與相應二抗室溫下孵育2 h，ECL發光。Image J軟件用于半定量分析特異性條帶的光密度值，將目的蛋白與β-actin光密度值比值作為相對表達量。實驗至少重復3次，結果取平均值。

1.4 隨訪所有子宮頸鱗狀細胞癌患者術后進行定期隨訪，隨訪截至2020年11月31日。采用患者門診復查及電話隨訪等方式，每6個月隨訪1次，開始時間為患者接受手術時間，死亡患者以死亡時間為終止時間，刪失者亦納入分析。

1.5 統計學分析所有數據采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計數資料率的比較采用χ2檢驗。SIAH2與HPV16感染、Ki-67蛋白的表達的關系采用Spearman等級相關分析。定量資料采用t檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及Log-rank檢驗比較組間總生存率(overall survival, OS)的差異。Cox比例風險模型篩選子宮頸鱗狀細胞癌患者預后的獨立預測因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮頸組織中SIAH2的表達SIAH2陽性定位于細胞核(圖1)，其在癌旁正常子宮頸組織、高級別鱗狀上皮內病變及子宮頸鱗狀細胞癌組織中的陽性率分別為5.00%(2/40)、48.33%(29/60)和75.83%(91/120)，差異有統計學意義(χ2=50.451，P<0.001)。子宮頸鱗狀細胞癌中，SIAH2表達與FIGO分期、淋巴結轉移和HPV16感染、Ki-67表達密切相關(P均<0.05)，與患者年齡及組織學分級無關(P均>0.05，表1)。Spearman相關性分析顯示，SIAH2表達與HPV16感染(r=0.340，P<0.001)和Ki-67表達(r=0.496，P<0.001)呈正相關。

表1 子宮頸鱗狀細胞癌中SIAH2表達與臨床病理特征的關系

圖1 SIAH2在子宮頸組織中的表達，SP法：A.癌旁正常子宮頸組織；B.高級別鱗狀上皮內病變組織；C.子宮頸鱗狀細胞癌組織

2.2 子宮頸組織中SIAH2的相對表達量RT-qPCR和Western blot法檢測結果顯示，在36對癌旁子宮頸組織及子宮頸鱗狀細胞癌組織中，SIAH2 mRNA的相對表達量分別為29.28±0.68和30.76±0.83，差異有統計學意義(t=-8.220，P<0.001，圖2A)；SIAH2蛋白的相對表達量分別為0.21±0.04和0.79±0.07，差異有統計學意義(t=-43.096，P<0.001，圖2B)。

2.3 SIAH2表達與子宮頸鱗狀細胞癌患者OS的關系生存分析顯示，SIAH2陽性和陰性患者的5年平均生存時間分別為42和56個月，5年中位生存時間分別為45和60個月。SIAH2陽性患者的生存時間顯著低于陰性患者(Log-rankWardχ2=12.905，P<0.001，表2，圖3)。單因素生存分析結果表明，SIAH2表達、FIGO分期及淋巴結轉移與子宮頸鱗狀細胞癌患者的OS相關(表2，圖3)。Cox多因素分析表明，SIAH2高表達是子宮頸鱗狀細胞癌患者總生存期的獨立預測因子(P<0.05，表3)。

圖3 子宮頸鱗狀細胞癌臨床病理因素與患者OS的關系：A.SIAH2表達；B.FIGO分期；C.淋巴結轉移

表2 子宮頸鱗狀細胞癌患者OS的單因素分析

表3 子宮頸鱗狀細胞癌患者OS的多因素分析

圖2 癌旁正常子宮頸和子宮頸鱗狀細胞癌組織中SIAH2 mRNA和蛋白的表達：A.RT-qPCR法檢測SIAH2 mRNA表達，***P<0.001；B.Western blot法檢測SIAH2蛋白表達；C1、C2.子宮頸鱗狀細胞癌組織；N1、N2.癌旁正常子宮頸組織

3 討論

子宮頸癌是全球婦女第四常見的惡性腫瘤[6]。2018年全球子宮頸癌新增約57萬例，死亡約31.1萬例。子宮頸癌也是我國婦女較常見及預后較差的腫瘤之一。子宮頸癌可分為鱗狀細胞癌、腺癌和小細胞癌等，其中鱗狀細胞癌占80%。眾多高危因素，如持續HPV感染、長期口服避孕藥、營養不良、吸煙、早期性行為和多名性伴侶等，均與子宮頸鱗狀細胞癌的發生、發展密切相關。手術治療是早期子宮頸鱗狀細胞癌的首選治療方法，而晚期患者通常同時接受化、放療，且預后較差[7]。因此，從分子水平尋找控制子宮頸癌的發生、發展及轉移的靶向治療越來越受到臨床重視，與子宮頸癌患者預后相關的生物學指標也將逐步被發現，這將有助于臨床醫師對患者治療方案的調整，提高患者生存率。

SIAH2基因定位于3Q25號染色體，其編碼的蛋白SIAH2是高度保守的E3泛素連接酶，經由RING FINGER區域參與一些底物蛋白的泛素化和水解作用，從而影響細胞的功能，如低氧反應、信號轉導通路、細胞生存、線粒體生物合成、細胞增殖、脂肪生成和神經中樞調節等[8-14]。近來研究發現，SIAH2作為癌基因在惡性腫瘤中發揮生物學作用，SIAH2在肺癌[15]、乳腺癌[16]、喉鱗狀細胞癌[17]和前列腺癌[18-19]等組織中均高表達。并且，隨著肺癌[15]及卵巢上皮性癌[4]惡性程度及臨床病理分期的增高，SIAH2表達水平也逐漸增高。在乳腺癌細胞系中過表達SLAH2，能夠促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力；而干擾SIAH2表達后，乳腺癌細胞的增殖侵襲能力下降[16]。本組免疫組化結果顯示，SIAH2在子宮頸鱗狀細胞癌組織中彌漫陽性，而僅在正常子宮頸組織有增殖活性的細胞中表達，并且其表達模式與Ki-67表達模式相同，說明SIAH2在有增殖能力的正常細胞和腫瘤細胞中表達，這與文獻報道一致[4]，從正常子宮頸組織→高級別鱗狀上皮內病變→子宮頸鱗狀細胞癌組織中，SIAH2的陽性率逐漸升高。RT-qPCR和Western blot結果也顯示，從正常子宮頸組織→子宮頸鱗狀細胞癌組織中，SIAH2 mRNA和蛋白的表達量顯著升高，提示SIAH2在子宮頸鱗狀細胞癌癌變過程中發揮促進作用。眾所周知，高危HPV感染與子宮頸癌的發生相關，HPV16常見于鱗狀細胞癌，HPV18更常見于腺癌，本組統計分析結果也發現，SIAH2表達與HPV16感染呈密切正相關，可借此推測SIAH2在子宮頸鱗狀細胞癌的發生過程中發揮作用。統計學分析還顯示，隨著FIGO分期增高SIAH2陽性率顯著增加，且與淋巴結轉移、Ki-67表達呈密切正相關，推測SIAH2與子宮頸鱗狀細胞癌的進展和轉移等生物學行為密切相關，并且可能與患者預后有關。

Huang等[20]發現在低氧條件下，白血病細胞株均有較低的PHD3、較高的HIF-1α和VEGF表達。SIAH2的抑制劑維生素K3能夠逆轉上述變化，并且促進慢性粒細胞白血病細胞對伊馬替尼化療藥物的敏感性，從而克服慢性粒細胞白血病的耐藥性。這些發現可為臨床應用SIAH2抑制劑治療慢性粒細胞白血病提供依據。由此可見，SIAH2可在腫瘤治療中發揮一定的作用。本組前期實驗在卵巢上皮性癌中發現，SIAH2高表達患者的5年生存率明顯降低，無瘤生存期顯著縮短，SIAH2是卵巢上皮性癌患者預后的獨立影響因素，提示患者預后不良[4]。那么，SIAH2在子宮頸鱗狀細胞癌患者預后評估中是否也起到一定作用呢？本實驗將常見的臨床病理因素納入單因素分析發現，SIAH2、FIGO分期和淋巴結轉移與患者的OS有關，與SIAH2陰性患者相比，SIAH2陽性者的OS下降，生存時間縮短，SIAH2陽性提示患者預后不良；多因素分析發現SIAH2是子宮頸鱗狀細胞癌患者總生存期的獨立預測因子。

綜上，本實驗結果表明，SIAH2可能在子宮頸鱗狀細胞癌發生、進展和轉移過程中發揮重要的促進作用。SIAH2具有成為子宮頸鱗狀細胞癌診斷、治療靶點的可能，可以幫助臨床評估患者的預后，然而本實驗只是初步驗證，其具體機制有待深入探究。