會診組織在免疫組化檢測中的質量分析

申敬偉，董芳莉，馬 卓，楊海軍

病理會診是病理科的常規工作之一，隨著我國各地區醫院醫療技術操作規范細則的實施，臨床病理工作中會診病理越來越多，主要包括疑難性病理會診、依懶性病理會診和確認性病理會診[1]。免疫組化技術是會診工作的重要手段，其有利于提高病理會診的質量，減少病理會診帶來的醫療風險。然而，送檢的會診蠟塊或切片常常組織處理欠佳，這給病理會診工作增加了一定難度，同時嚴重影響了免疫組化檢測結果的穩定性和準確性。如何把控會診組織在免疫組化檢測中的染色質量，本文結合我院會診組織免疫組化檢測情況進行分析，總結如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取2019年1月～2019年12月安陽市腫瘤醫院接收的行免疫組化檢測的會診組織706例。其中會診蠟塊601例，處理不佳的101例；會診白片105例，質量不合格的10例。通過制定會診組織在免疫組化檢測中的規范化流程，對外院會診蠟塊、切片和白片進行改善。

1.2 儀器Roche Ventana XT全自動免疫組化儀和Leica Bond Max全自動免疫組化儀。

1.3 試劑ER、PR、HER-2和Ki-67為Roche即用型一抗，其余常規試劑均為邁新即用型一抗，二抗檢測系統為Roche和Leica兩家公司的配套封閉試劑。

1.4 方法不同抗體設立相應的陽性對照組織，3 μm厚連續切片，65 ℃烤片1 h后進行分片，按Roche Ventana XT和Leica Bond Max免疫組化自動化染色平臺的SOP操作。

2 結果

按照本實驗室會診組織在免疫組化檢測中的規范化流程和操作方案，會診蠟塊切片完整，厚薄均勻；會診白片更換黏附載玻片，添加陽性對照。免疫組化染色定位準確，背景干凈，核復染適度，陽性對照正確(圖1～3)，質量控制分析4例染色合格，其余均為優良，優良率96.4%。

3 討論

免疫組化是用已知抗體與抗原發生特異性結合，并通過化學反應使標記在與抗原結合后的特異性抗體上的顯色劑顯色，以確定組織細胞內抗原的存在，對其進行定位、定性及半定量分析。免疫組化是一個多步驟、多條件的復雜過程，其規范化和標準化涉及整個免疫組化檢測的全流程，包括組織前處理、檢測步驟、結果判讀、質量控制等各個環節。隨著病理會診免疫組化檢測數量的增多，本實驗室制定了一套會診組織從蠟塊或白片質量評估開始，切片、烤片、抗原修復、抗體濃度、檢測系統、陽性對照等全方面的規范化操作方案，推進免疫組化技術在會診組織中的規范化和標準化檢測，提高檢測的準確性，具體實施措施如下。

3.1 評估會診蠟塊會診蠟塊多來自基層單位，組織處理欠佳的情況較為普遍。通常表現為組織內陷、硬脆、韌等。組織內陷主要是組織固定不佳，導致脫水劑難以進入組織，大量水分殘留在組織內。對于這些會診蠟塊本科室采用黏片法[2]，即把載玻片盒子里的隔離紙撕成和蠟塊一樣的大小，沾冰水貼在已修好片的蠟塊上再切，切片就黏在紙片上，直接拿出紙片反向放入漂片機內，同時嚴格控制水溫不宜太高。在病理會診工作中，蠟塊硬，跳刀，顫痕嚴重，蠟塊易崩裂；蠟塊脆，組織易破碎，出現粉末狀等，這些情況常是由于固定不足和脫水不良引起，對于這類會診蠟塊在切片時將厚度調薄一點，蠟塊不可太冰，可以在冰水里浸泡1～2 min，或者邊切邊用嘴向蠟片吹氣，使蠟塊切面保持濕潤，利于制片。越來越多的研究表明，不標準的組織固定是導致免疫組化結果不準確的主要因素，常導致不同的染色結果[3]。固定的意義是保存組織或細胞的抗原性，防止抗原丟失或彌散，因此標本應盡可能保持新鮮并及時進行固定。常用的固定液為10%中性福爾馬林緩沖液(pH 7.2～7.4)，組織離體后盡可能在30～60 min內固定。延遲固定可引起蛋白質降解，導致背景非特異性著色增加，減弱免疫組化的染色強度。固定時間6～48 h[4]，對于活檢小組織固定時間亦不應少于6 h。標準化的組織脫水、透明、浸蠟流程及試劑更換程序是獲得優質免疫組化制片的前提，脫水、透明等過程應在室溫下進行，盡量減少組織抗原的損失。組織塊大小控制在2 cm×1.5 cm×0.3 cm為宜。浸蠟或包埋的石蠟應控制在65 ℃或65 ℃以下。組織處理的任何過程中，標本干涸組織形態和抗原都會受到損害，組織處理應嚴格按照科室相關SOP文件的要求進行。

3.2 評估會診白片外院會診白片部分存在玻片黏附質量差或非黏附性玻片，組織固定處理不佳，切面有氣泡、皺褶等質量問題，易出現脫片和非特異性染色。如果是非黏附性玻片，直接退回玻片，換用黏附性玻片或重新調取蠟塊重新制片。目前本實驗室有Roche Ventana XT和Leica Bond Max兩種免疫組化自動化染色平臺，Roche Ventana XT采用噴射式清洗技術均勻而徹底地清洗，降低背景染色，同時也是造成染色會診白片脫片率偏高的主要原因；Leica Bond Max最大特點是試劑側面滴加，最大限度減少對組織的傷害，脫片率低[5]。因此，為減少脫片率，本實驗室偏向應用會診組織在Leica Bond Max上檢測。會診白片多為非親水性，質量參差不一，本實驗室ER和HER-2試劑采用Roche即用型，Roche Ventana XT需要玻片為親水性，因此會診白片在檢測前需在脫脂牛奶中浸泡30 min，以改善切片的親水性，保證試劑均一地分布，避免假陰性的產生和“階梯效應”。同時，免疫組化檢測應盡量使用新鮮切片(1周以內的切片視為新鮮切片)，切片長久放置后免疫穩定性的丟失會導致染色強度降低、陽性細胞數量減少。切片厚度為3～5 μm，推薦烤片溫度為63～65 ℃，1～2 h，忌高溫長時間烤片。

3.3 建立陽性對照體系設置陽性對照體系是免疫組化染色質量控制的重要措施之一[6]。陽性對照應按照國內檢測指南/專家共識設置，對于與腫瘤靶向藥物治療相關的檢測項目必須設置陽性對照。陽性對照是驗證操作步驟是否正確及染色結果是否準確的關鍵，根據對照染色結果可以判斷操作的準確性和試劑的有效性，本實驗室使用已被證明含有靶抗原成分的組織作為外部陽性對照，如ER、PR陽性對照選用ER、PR陽性的乳腺癌、子宮頸癌或子宮內膜癌標本，HER-2陽性對照選用HER-2 2+及3+的乳腺癌標本，同時外部陽性對照組織選擇低表達的檢測組織，低表達的外部陽性對照可以明確由于檢測體系的微弱變化而導致的免疫組化染色不穩定，強陽性對照可能導致弱陽性組織出現假陰性結果。因此，對于外院會診蠟塊組織，在切片的同時加上陽性對照；對于外院會診白片，在黏附載玻片的空白區再加上陽性對照組織。為確保抗原活性，陽性對照片現用現切，且不可長時間保存。本實驗室一般備1周陽性對照的切片量，-20 ℃保存備用。

3.4 儀器設備的質控嚴格遵照全自動免疫組化染色機的操作流程，制定每種儀器的保養計劃，包括日保養、周保養和月保養；記錄每種試劑的克隆號、批號、有效期；更換抗體后，用陽性和陰性組織進行有效性驗證。建立每種抗體的SOP文件嚴格執行，并及時更新。最少的背景以及標記目標抗體的強表達是理想的結合[7]。

3.5 參加室間質控積極參與國際及國內免疫組化染色質量評估，動態評價本實驗室免疫組化染色質量，不斷改正不足。本科室2014年參加國家衛建委病理質控中心(PQCC)的免疫組化室間質控，2013年開始每年參加河南省病理質控中心組織的免疫組化室間質評，均順利通過。

總之，病理會診已成為病理科的日常工作，免疫組化技術已成為病理會診中重要的檢測手段，因此需要建立病理會診在免疫組化檢測中的規范化和標準化流程，以確保病理會診工作高效優質完成。