一種腸類器官樣本快速石蠟塊的制作方法

李 麗，陳 菲，包春娟，周琪琪，陳紅英

類器官于2009年由Sato等[1]首次報道，其能較好地模擬體內細胞三維生長的生理條件，目前已廣泛應用于疾病的研究并成為最具前景的實驗技術。腸道病理的藥理學、毒理學或微生物研究中常采用人或小鼠腸道組織進行腸類器官培養[2]。腸類器官培養成為研究和治療腸道疾病可行的方法[3]，也是一種全新的消化道疾病體外研究模型。腸類器官在Matrigel三維基質膠內培養，通常被培養在24孔培養板內，由Matrigel基質膠包裹，基質膠直徑5 mm，厚0.5～1 mm，培養2周左右彌散于基質膠內的腸類器官肉眼呈針尖大小。培養結束需借助病理技術手段，檢測培養的腸類器官組織細胞的形態結構及與相關蛋白的表達情況，但目前對類器官的包埋技術仍有較高難度。本實驗室采用快速脫水流程制作出適用于常規HE及免疫熒光雙重染色的優質腸類器官石蠟切片，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料人結腸組織采用人腸類器官培養基IntestiCult Organoid Growth Medium(Stem Cell Technology公司，#06010)在基質膠Matrigel(Corning，#356237)內培養2周左右形成的腸類器官樣本30例，10%中性緩沖福爾馬林，無水乙醇，二甲苯，蘇木精染液(貝索公司，BA4041)，伊紅染液(Thermo公司，7111)，EDTA抗原修復液(福州邁新公司，MVS-0099)，mouse anti-E-Cadherin抗體(1 ∶100，CST)，rabbit anti-Ki-67抗體(1 ∶200，CST)，Alexa Fluor 488 goat anti-mouse熒光抗體(1 ∶500，Invitrogen公司)，Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit熒光抗體(1 ∶500，Invitrogen公司)，Wash Buffer(Dako公司，DM831)，DAPI(Sigma公司，D9542-5MG)，增強型抗淬滅封片劑(佰諾全景0022001010)，Super PAP Pen超級免疫組化油筆(福州邁新公司，PEN-0002)，全自動脫水機(Thermo Excelsior AS)，全自動封片儀(Thermo ClearVue)，WSI全數字切片掃描儀(3DHISTECH Pannoramic SCAN)，正置熒光顯微鏡(Leica DM4000B)。

1.2 方法

1.2.1進脫水機前處理 將培養在24孔板內的腸類器官樣本用10%中性緩沖福爾馬林固定2 h；雙蒸水漂洗3次，每次1 min；將75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分別加入24孔板內脫水10 min；脫水后將有一定硬度的包裹腸類器官樣本的基質膠用眼科鑷輕輕取出，放入大小5 cm×5 cm的單層卷紙內且基質膠底面朝下放置，并在基質膠周圍用鉛筆畫圈定位，折疊好后放入已打印好編號的包埋盒內。

1.2.2快速脫水 將包埋盒放入全自動脫水機進行脫水、透明、浸蠟流程，快速脫水程序設置如下：55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)、無水乙醇(Ⅰ、Ⅱ)分別5 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別5 min，63 ℃石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，整個過程耗時不超過2 h。

1.2.3包埋與石蠟切片 打開卷紙，在鉛筆劃圈處找到腸類器官樣本，用電熱鑷將樣本迅速放入注滿蠟液的熱包埋模具[4]中央底部，轉入包埋機小冷臺輕壓平，待底部凝固迅速放上包埋盒底盒再移至大冷凍臺速冷。常規石蠟切片，腸類器官樣本連續切片直至切完整個基質膠，避免再次切片時損失樣本，切片厚度4 μm。

1.2.4常規HE及免疫熒光雙重染色 (1)常規HE染色流程：石蠟切片常規脫蠟水化后入蘇木精染液2 min，0.5%鹽酸乙醇分化數秒，溫水返藍后入伊紅染液20 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，全自動封片儀封片，WSI全數字切片掃描儀掃片。(2)免疫熒光雙重染色流程：石蠟切片常規脫蠟水化后，EDTA(pH 9.0)抗原修復液97 ℃修復30 min，山羊與驢混合血清[5]室溫封閉30 min，滴加一抗混合液(E-Cadherin與Ki-67工作液1 ∶1混合)4 ℃孵育過夜，次日室溫復溫后Wash Buffer漂洗3次，避光滴加熒光二抗混合液(Alexa Fluor 488與Alexa Fluor 647熒光二抗工作液1 ∶1混合)37 ℃避光孵育30 min，甩掉二抗直接滴加DAPI工作液，2×SSC漂洗，雙蒸水洗后用抗淬滅劑封片，正置熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

眼觀可見培養在24孔培養板內呈類圓形，厚0.5～1 mm，直徑5 mm的Matrigel基質膠，基質膠內彌散培養的腸類器官樣本呈針尖大小。腸類器官樣本石蠟切片HE染色可見典型的空腔樣腸類器官結構及萌芽結構，上皮細胞核呈藍色，細胞質呈粉紅色(圖1)。腸類器官樣本石蠟切片行E-Cadherin與Ki-67免疫熒光雙重染色，可見典型的空腔樣腸類器官結構及萌芽結構上皮均高表達E-Cadherin蛋白，即幾乎所有腸類器官上皮細胞膜顯示綠色熒光，部分增殖上皮表達Ki-67蛋白，即部分腸類器官上皮細胞核顯示紅色熒光且與細胞核染料DAPI重疊，無明顯背景熒光(圖2)。

圖1 腸類器官樣本在基質膠內培養后大體及HE染色圖：A.箭頭所指兩個類圓形區域為腸類器官用Matrigel三維基質膠培養固定后，滴染1滴伊紅染液，基質膠內生長的腸類器官樣本肉眼呈針尖大小；B.HE染色可見典型的空腔樣腸類器官結構及萌芽結構，上皮細胞核呈藍色，細胞質呈粉紅色 圖2 E-Cadherin與Ki-67免疫熒光雙重染色：A.細胞核染料DAPI呈藍色；B.腸類器官上皮高表達E-Cadherin蛋白，即幾乎所有腸類器官上皮細胞膜顯示綠色熒光；C.部分增殖上皮表達Ki-67蛋白，即部分腸類器官上皮細胞核顯示紅色熒光；D.E-Cadherin與Ki-67免疫熒光雙重染色與細胞核染料DAPI重疊

3 討論

類器官培養是一種三維空間培養，是過去10年干細胞培養較大的進展之一。除了腸類器官培養，近幾年文獻還報道肝類器官[6]、腦類器官[7]、腎類器官[8]等類器官培養技術，為體外研究相關組織器官疾病提供了全新的體外研究模型。培養的類器官樣本通過常規HE染色觀察類器官的組織細胞形態結構，利用免疫熒光染色技術分析類器官內蛋白定位及表達情況。腸類器官三維培養樣本小且彌散于Matrigel基質膠內，基質膠固定前后用鑷子夾取均易夾碎，從24孔板取出環節操作十分困難。作者經反復實驗發現，基質膠固定后行短時間梯度乙醇脫水容易變硬，易從24孔板取出。由于大體觀腸類器官樣本只有針尖大小，石蠟包埋切片環節容易將腸類器官樣本切掉，作者發現切片成功需注意以下幾點：(1)進脫水機前處理環節，送檢的腸類器官樣本進脫水機前除使用10%中性緩沖福爾馬林固定外[9]，還需利用梯度乙醇脫水硬化的作用將24孔培養板內包裹腸類器官的基質膠處理變硬，利于眼科鑷夾出變硬后的腸類器官樣本。再用鉛筆在卷紙上圈出樣本放置的位置，經實踐證實這樣操作后期打開包埋紙時可快速找到樣本。(2)脫水包埋環節：使用本實驗室已有的快速細胞蠟塊脫水流程[55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)、無水乙醇(Ⅰ、Ⅱ)分別5 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別5 min，63 ℃石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，整個過程耗時不超過2 h)]處理的腸類器官樣本質量好不發脆，石蠟切片無厚薄不均、裂痕、顫痕、褶皺現象，易于切出優質的連續切片。包埋環節參照羅添友等[4]報道的用熱包埋模具包埋脫水后薄如紙的腸類器官樣本，在此文獻基礎上改良包埋操作中的一個小細節，即一次性將熱包埋模具填充滿蠟液，避免二次充蠟改變腸類器官樣本底面平整的位置，樣本包埋平整可減少后續石蠟切片粗修次數，采用細修修出完整樣本面，再一次性連續切片切完整個基質膠包裹的腸類器官樣本，本實驗每張防脫玻片撈3張石蠟切片，一個腸類器官石蠟塊連續切片后可以撈片15張左右。(3)免疫熒光雙重染色環節：本實驗中兩個抗體來源于不同宿主，通過間接法免疫熒光雙重染色技術[5]可以將兩種不同來源的一抗同時孵育，節約染色操作時間。為避免熒光串色，本實驗選擇Alexa Fluor 488熒光通道與Alexa Fluor 647熒光通道的激發波長與發射波長均無交叉。本實驗還用抗淬滅封片劑有效避免熒光淬滅問題。

目前，本科室已順利完成50余例腸類器官樣本HE染色及免疫熒光雙重染色實驗，染色效果均良好，該腸類器官樣本快速石蠟塊的制作方法值得推廣，也值得應用到肝、腎、腦及心臟等類器官培養樣本的石蠟切片制作中。