哈茨木霉拌種對冬小麥生長、土傳病害及根際真菌群落的影響

扈進冬 楊在東 吳遠征 魏艷麗 楊合同 盧德鵬 李紀順

摘要 為了明確哈茨木霉LTR-2拌種處理冬小麥的田間效果，為木霉拌種劑的推廣應用提供依據，本試驗于2016年-2018年連續3年，研究了哈茨木霉LTR-2拌種對小麥出苗率、幼苗生長、小麥紋枯病和莖基腐病發生情況和產量的影響，通過高通量測序和FUNGuild預測分析了木霉拌種對小麥根際土壤中真菌群落組成的影響。結果表明，哈茨木霉LTR-2拌種可以提高小麥的出苗率和冬前分蘗數;對小麥紋枯病的平均防效60%以上;對小麥莖基腐病的平均防效65%以上，優于6%戊唑醇懸浮種衣劑;與不拌種對照相比，哈茨木霉LTR-2拌種處理增產4.3%～634%，增產效果略高于6%戊唑醇懸浮種衣劑;木霉拌種可以降低小麥根際土壤中病原真菌的相對豐度，特別是土壤中鐮孢屬真菌的相對豐度。因此，哈茨木霉LTR-2可以作為化學拌種劑的綠色替代產品用于小麥生產。

關鍵詞 哈茨木霉; 拌種; 冬小麥; 根際真菌群落

中圖分類號： S 473

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020409

Effects of seed dressing treatment with Trichoderma harzianum on the growth of winter wheat seedlings， soil borne diseases and rhizosphere fungal community

HU Jindong1， YANG Zaidong2， WU Yuanzheng1， WEI Yanli1， YANG Hetong1， LU Depeng3， LI Jishun1*

（1. Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology， Institute of Ecology， Qilu University of Technology

（Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250103， China; 2. Shandong Luyan Quality Breeds Co.， Ltd.，

Jinan 250100， China;? 3. Shandong Tenov Pesticides Co.， Ltd.， Weifang 262200， China）

Abstract

This study aimed to verify the field effects of seed dressing treatment with Trichoderma harzianum LTR-2 on winter wheat， and provide a basis for the promotion and application of Trichoderma seed dressing agents. The effects on wheat emergence rate and seedling growth， the incidence of wheat sharp eyespot and crown rot and yield were studied for three consecutive years from 2016 to 2018 after T.harzianum LTR-2 seed dressing treatment. At the same time， high-throughput sequencing and FUNGuild were used to analyze the fungal communities in rhizosphere soil of wheat between T.harzianum LTR-2 seed dressing and the control. The results showed that T.harzianum LTR-2 seed dressing could increase wheat emergence rate and tiller number before winter. The average control effects reached over 60% against wheat sharp eyespot， and over 65% against crown rot， which was better than tebuconazole 6% FSC treatment. Compared with the control， T.harzianum LTR-2 seed dressing treatment increased wheat yield by 4.3%-6.34%， which was also slightly better than tebuconazole 6% FSC treatment. Through the analysis of fungal community， we found that T.harzianum LTR-2 seed dressing could reduce the relative abundance of pathogenic fungi in wheat rhizosphere soil， especially the abundance of Fusarium spp. Therefore， T.harzianum LTR-2 can be used as a good substitute for chemical seed dressing agent in wheat production.

Key words

Trichoderma harzianum; seed dressing; winter wheat; rhizosphere fungal community

種子包衣是促進農作物增產豐收的一種重要技術措施，種子包衣可以防治土傳病害和地下害蟲，促進植株生長發育，提高作物產量、質量，增加農民收入，是我國重點推廣的一項農業高新技術[1-3]。小麥在我國種植面積僅次于水稻，約2 400萬hm2，是我國重要的主糧作物[4]。近年來伴隨著農業種植制度改革，高產品種的應用推廣，耕作方式的變化以及秸稈還田技術的推廣應用，土傳病害有不斷加重的趨勢，如紋枯病、莖基腐病等小麥土傳病害發生日趨嚴重，這些病害已經成為影響我國小麥產量和質量的重要因素，尤其是小麥莖基腐病近年來發病率逐年增加，已經成為影響小麥安全生產的主要病害。目前戊唑醇、苯醚甲環唑、咯菌腈等化學殺菌劑常用于拌種防治小麥病害，拌種處理時化學殺菌劑選擇和使用不當，會對小麥生長發育產生藥害，導致出苗推遲、出苗率低、畸形苗等[5-7]。同時，化學農藥長期連續使用易造成病原菌的抗藥性，導致農藥殘留，不利于農業的可持續發展。

木霉LTR-2是本實驗室分離的一株生防菌，經鑒定為哈茨木霉Trichoderma harzianum。其對蔬菜灰霉病菌Botrytis cinerea、小麥紋枯病菌Rhizotonia cerealis、棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum等多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，已被用于黃瓜灰霉病、小麥紋枯病的防治[8-10]。其作為生物肥料使用還具有促生增產的作用，同時還可以緩解土壤鹽漬化對作物造成的損害[11-12]，是一株非常有開發潛力的生防菌株，但目前主要以噴霧、穴施、蘸根等方式使用，拌種僅用于小麥紋枯病的防治。為了充分開發哈茨木霉LTR-2在小麥拌種方面的應用潛力，了解其對小麥生長及產量的影響，以及對小麥莖基腐病的防治效果，本研究利用哈茨木霉LTR-2制備的拌種劑（以下簡稱木霉拌種劑）在山東泰安岱岳區開展了為期3年的木霉拌種田間應用試驗，同時在第3年采用高通量測序方法對小麥根際真菌群落進行了跟蹤分析，以期為木霉種衣劑的推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為‘濟麥22，泰安登豐種業有限公司提供;木霉拌種劑（含2億哈茨木霉LTR-2活孢子/g）：山東省科學院生態研究所制備，對照藥劑為6%戊唑醇懸浮種衣劑（FSC），以色列馬克西姆化學公司。

1.2 試驗地概況

試驗田塊位于山東省泰安市岱岳區大汶口鎮，面積8 704 m2，其中測試處理區分為兩塊，面積均為3 808 m2，空白對照區面積為1 088 m2，不設重復，2016年-2018年連續種植3年小麥。試驗田塊地勢平坦，肥力中上等，pH 6.3，土壤堿解氮含量126 mg/kg，有效磷含量28.5 mg/kg，速效鉀含量114 mg/kg，有機質含量1.9%左右，土壤含水量適中，小麥種植前茬作物為玉米，收獲后全部粉碎并還田處理。播種前施用硫酸鉀復合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15，湖北新洋豐肥業股份有限公司生產）750 kg/hm2作為基肥，返青拔節期追施尿素225 kg/hm2（魯西化工集團股份有限公司生產）。播種量150 kg/hm2，機械播種。試驗時間2015年10月14日-2016年6月5日，2016年10月10日-2017年6月8日，2017年10月15日-2018年6月8日。

1.3 處理劑量和處理方法

處理1：木霉拌種劑，以100 g制劑拌10 kg種子;處理2： 6%戊唑醇懸浮種衣劑，以10 mL制劑拌10 kg種子;空白對照不拌種。

1.4 數據調查

出苗率調查：每處理選取種子300粒，分3份每份100粒，3個處理共分9行，人工種植于相鄰地塊，各處理隨機排列，用于出苗率和苗期生長狀況調查，小麥播種后7 d左右調查各處理小麥出苗情況，記錄出苗時間，齊苗時（播種后15 d）進行出苗率調查。

小麥越冬前生育指標調查：小麥越冬前停止生長時（每年12月10日左右）調查各小區小麥的株高、分蘗數量、鮮重等。

小麥紋枯病調查：參照GB/T 17980.108-2004農藥田間藥效試驗準則（二）第108部分：殺菌劑防治小麥紋枯病[13]。

小麥莖基腐病調查：試驗地塊從2017年開始發現莖基腐病發生，故本試驗從2017年開始莖基腐病調查，調查方法參照張鵬等病害分級標準[14]。

小麥收獲期測產：采用收割機收割實際測產。

1.5 小麥根際土壤真菌群落分析

于2017年-2018年冬小麥田間試驗期間，播種后30、60、150、180、210 d分5次（分別代表苗期、分蘗期、返青期、拔節期、抽穗期）采集木霉拌種處理和空白對照不拌種的小麥根際土壤。采樣方法：小區前、中、后分3部分作為重復處理，每部分隨機取5個樣點，每樣點隨機選取10株麥苗，挖出根系，用抖根法采集附著在根際表面的土壤，混勻后為該樣點的根際土壤樣品，將土壤樣品過20目細篩，取03 g根際土壤，按E.Z.N.A.soil DNA kit （OMEGA， USA） 土壤微生物DNA提取試劑盒的試驗步驟提取土壤微生物總DNA，-20℃保存。

上述樣品由生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序，測序選用TS3/TS4通用引物，并由Illumina Miseq PE300測序平臺完成。

1.6 數據處理與統計分析

小麥生長及木霉防治土傳病害數據采用Excel （Ver.2013）進行統計分析，差異顯著性分析采用Duncan氏新復極差法。

高通量測序完成后經過數據處理獲得在97%相似水平下的OTU表，在此基礎上本文重點考察了木霉拌種處理對小麥根際真菌群落功能類群的影響，使用FUNGuild數據庫（http：∥www.stbates.org/guilds/app.php）[15]進行真菌功能預測分析。木霉拌種處理后根際土壤真菌FUNGuild功能分類組成和鐮孢屬相對豐度使用R語言（3.6.1）ggplot2包繪制[16]。

2 結果與分析

2.1 木霉拌種劑對小麥出苗及麥苗素質的影響

2016年-2018年3年田間試驗表明，木霉拌種提高了小麥的出苗率（圖1a），出苗率較不拌種對照增加了2.2%～2.6%，但二者之間差異不顯著;與化學藥劑6%戊唑醇FSC拌種相比，2016年和2018年出苗率顯著增高（P<0.05）。冬前幼苗素質調查結果表明，木霉拌種后，株高在2016的試驗中，鮮重在2017的試驗中顯著高于空白對照，其他年份，這兩個指標與不拌種處理、化學拌種處理相比略有提高（圖1b、圖1c），但差異不顯著;木霉拌種處理的冬前分蘗數較不拌種處理顯著增加（P<0.05），平均增加0.51～0.7個（圖1d），并且2016年-2018年連續3年試驗結果一致。

2.2 木霉拌種對小麥紋枯病和莖基腐病的防治效果

試驗結果（表1）表明，木霉拌種對小麥紋枯病和莖基腐病均有較好的防治效果。6%戊唑醇FSC拌種的試驗田塊2016年—2018年紋枯病病情指數整體趨于穩定，而莖基腐病病情指數呈增長趨勢;木霉拌種處理田塊對小麥紋枯病3年的防治效果為6017%～69.52%，除2016年外，木霉拌種處理防治效果略低于6%戊唑醇FSC拌種處理;木霉拌種處理對小麥莖基腐病兩年的防治效果分別為6526%和6773%，其中2018年的防治效果顯著優于6%戊唑醇FSC拌種處理，田塊中莖基腐病病情指數也趨于穩定。

2.3 木霉拌種處理對小麥產量的影響

2016年-2018年連續3年對試驗田塊采用收割機采收實際測產，測產結果見表2，可以看出木霉拌種處理和6%戊唑醇FSC拌種處理比不拌種處理分別增產4.30%～6.34%和0.36%～3.47%，以木霉拌種和6%戊唑醇FSC拌種3年的增產率作為3次重復做差異顯著性分析，結果表明，木霉拌種處理顯著優于6%戊唑醇FSC拌種處理（P=0.04），說明木霉拌種劑可以作為化學殺菌劑的綠色替代品用于小麥拌種，降低化學農藥使用。

2.4 木霉拌種對小麥根際真菌群落的影響

根據FUNGuild數據庫在線比對結果，對木霉拌種和未拌種兩組小麥根際土壤真菌的guild分類進行了統計分析，結果如圖2所示，木霉拌種處理的小麥5個不同發育時期除分蘗期外，根際真菌群落中植物病原菌類群的相對豐度均比未拌種組有所降低，特別是在苗期和返青期。

此外，我們依據OTU表分類注釋結果對根際土壤中鐮孢屬真菌的含量進行了比較，結果如圖3所示，發現伴隨小麥的生長，根際中鐮孢屬真菌含量呈現逐步增加的趨勢，而通過木霉拌種處理可以有效降低根際土壤中鐮孢菌的相對含量，其中木霉拌種后在分蘗期根際鐮孢菌相對含量顯著降低（P<0.05），推測這應該是木霉拌種可以有效防治鐮孢菌引起的小麥莖基腐病發生的重要原因之一。

3 討論

木霉可促進植物生長已廣為認可，其對蔬菜，糧、棉、油作物，花卉、牧草等植物均有促生作用。其促生機制主要有：產生植物生長調節劑，如吲哚乙酸、玉米素、赤霉素等[17-18];產生可以抑制和降解根際有害物質，抑制土壤病原真菌的代謝產物;提高植物營養利用能力等[19]。不同的木霉促生機制不同，但大多是多種促生機制協同作用。從本研究進行的3年木霉拌種田間試驗可以看出，木霉拌種可以促進小麥種子提前萌發，拌種小麥一般較不拌種小麥提前1～2 d出苗，并且出苗率增加2.2%～26%，苗期麥苗的素質也有所提高，其中冬前分蘗數明顯增加。我們在對哈茨木霉LTR-2代謝產物進行分析時發現它可以分泌一些植物生長調節劑，如吲哚乙酸、赤霉素等，推測這可能是木霉拌種提高小麥冬前分蘗數的一個重要原因，而冬前分蘗數的增加為小麥成穗增產提供了可靠保障。

同時，木霉拌種對小麥紋枯病和莖基腐病等土傳病害控制效果明顯，可以顯著降低小麥苗期的病情指數，減少小麥成熟期白穗率。采用高通量測序對小麥根際真菌群落的分析表明，木霉拌種降低了小麥根際病原真菌豐度，木霉拌種的小麥根際土壤中鐮孢菌的相對豐度（2.25%～16.02%）在小麥多個發育時期較不拌種處理小麥根際土壤中的鐮孢菌相對豐度（614%～21.68%）有所降低，這個結果很好地印證了FUNGuild預測的結果，然而，高通量測序結果發現絲核菌僅在未拌種對照的抽穗期中存在少量的reads，其他處理和時間段均未出現絲核菌reads，這一結果和我們田間調查結果不一致，究其原因可能與擴增子測序選用的真菌ITS擴增區域有關，該區域可能并不適用于絲核菌的有效擴增，此外，采集的根際土壤中絲核菌相對豐度比其他真菌低，不易檢測也可能產生上述結果。對于這一問題，在今后的試驗中我們希望通過提高測序通量或采用針對絲核菌特異序列的qPCR檢測方法來探查和印證。

綜上所述，木霉拌種處理降低了土壤中病原真菌總體豐度，減少了小麥土傳病害發生，是小麥產量提高的一個重要因素。3年的田間應用數據表明，木霉拌種處理與不拌種處理相比穩定增產4%以上，同時木霉是一種環境友好型綠色生物制劑，可用于替代化學殺菌劑防治小麥土傳病害，降低化學農藥使用量，實現作物病害綠色防控，因此具有巨大的應用推廣前景。

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（責任編輯：楊明麗）