深綠木霉HB20111產揮發性物質及其功能分析

扈進冬 隋麗娜 李玲 陳凱 李紀順

摘要 為了解深綠木霉HB20111產揮發性物質的成分以及潛在的生物學功能，采用頂空氣相色譜-質譜法測定了深綠木霉HB20111產揮發性物質的主要成分，并進行了成分分析;采用對扣法測定了深綠木霉HB20111產揮發性物質對5種植物病原菌的抑菌率;同時測定了深綠木霉HB20111產揮發性物質對小麥幼苗生長的影響。結果表明，深綠木霉HB20111產揮發性物質烯類的相對含量最高，為49.68%、醇類為21.78%，酮類為8.56%，其余類別相對含量較低;這些揮發性物質對5種植物病原菌均有一定的抑制效果，其中對立枯絲核菌抑菌率最高，為5062%;揮發性物質還可以促進小麥幼苗生長，與對照相比，對小麥幼苗的株高有顯著的促進作用（P<0.05）。這些結果為深綠木霉HB20111的開發應用提供了理論基礎。

關鍵詞 深綠木霉; 揮發性物質; 氣質聯用; 吡喃酮

中圖分類號： S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020655

Identification and functional analysis of volatile organic compounds from Trichoderma atroviride HB20111

HU Jindong1， SUI Lina2， LI Ling1， CHEN Kai1， LI Jishun1*

（1. Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology， Institute of Ecology， Qilu University of Technology

（Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250103， China; 2. Institute of Biological Engineering， Qilu University of

Technology （Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250353， China）

Abstract

In order to determine the components and potential biological functions of volatile organic compounds （VOCs） produced by Trichoderma atroviride HB20111， the headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME-GC-MS） was used to analyze the VOCs from T.atroviride HB20111. The inhibition rate of VOCs against five plant pathogenic fungi was measured by using plate-to-plate method， and the promoting effect of the VOCs on the growth of wheat seedlings was explored. The results showed that there were three major classes of VOCs， including alkenes，alcohols and ketones， accounting for 4968%， 21.78% and 8.56% of the total amount， respectively. These VOCs had certain inhibitory effects on the five plant pathogens， and the highest inhibition rate was 50.62% against Rhizoctonia solani. The VOCs also promoted the growth of wheat seedlings and significantly promoted the plant height of wheat seedlings （P<005） compared with the control. These results provide a basis for further application of T.atroviride HB20111.

Key words

Trichoderma atroviride; volatile organic compounds （VOCs）; gas chromatography-mass spectrometry; 6-pentyl-2H-pyran-2-one （6PP）

近年來，木霉Trichoderma spp.作為生物防治菌劑防治植物病害已逐漸被人們所熟知[1-2]。同時，已有多種木霉被登記為生物肥料、生物農藥、植物刺激劑等產品，廣泛用于農業生產。在世界范圍內，木霉是最重要的生物農藥制劑來源之一，如在印度有大約250種木霉及其衍生物的生物殺菌劑產品[3];我國也有18個已在農業部正式登記的木霉生物農藥產品。木霉除具備優良生防功能外，還可以促進植物側根和根毛生長、提高植物生物量、高度、葉片數量、分蘗、分枝、果實產量等[4-5];對植物光合作用、氣孔導度、氣體交換、營養物質吸收同化等生理過程具有正向調控作用[6-7];可以分泌植酸酶和有機酸類物質促進植物根系對養分的溶解和吸收[8];通過提高植物氧化應激等方面的作用改善植物在脅迫條件下的生長和繁殖[9-10]。因此，在當前提倡綠色生態健康發展環境下，木霉作為化學殺菌劑的有效替代品具備大規模應用的潛力。

深綠木霉Trichoderma atroviride HB20111是本實驗室篩選獲得的一株優良生防菌株，已發現通過小麥拌種可以促進小麥的根系發育和冬前分蘗，對小麥莖基腐病也有較好的防治效果，還發現其在生長過程中會產生濃郁的椰香味揮發性物質。有研究發現這種真菌產生的揮發性物質有些可以通過激活植物的防御反應抑制植物病原菌的增殖[11]。為了解深綠木霉HB20111所產揮發性物質的成分以及潛在的生物學功能，本文通過頂空氣相色譜-質譜法對其產生的揮發性有機物進行了測定和成分分析，研究了木霉揮發性物質的種類和含量及其對不同植物病原真菌抑制效果和對植物的促生作用，以期為該菌的開發利用提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養條件

深綠木霉 Trichoderma atroviride HB20111， 假禾谷鐮孢Fusarium pseudograminearum、尖鐮孢F.oxysporum、層出鐮孢F.proliferatum、麥根腐平臍蠕孢Bipolaris sorokiniana、立枯絲核菌Rhizoctonia solani由實驗室分離保存。培養基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），115℃，30 min滅菌后備用。上述菌株至少在60 mm直徑的PDA平板上活化兩次，培養溫度（28±0.5）℃。

1.2 深綠木霉HB20111產生的揮發性物質鑒定

為進行氣相色譜離子遷移譜（GC-MS）分析，將預培養活躍生長的菌落邊緣一個直徑5 mm的瓊脂塊倒置接種在20 mL頂空瓶中，瓶底裝有5 mL PDA。瓶子用特氟龍螺旋蓋封閉，并加金屬蓋。放置于（28±0.5）℃培養箱中培養7 d。固相微萃取頭在氦氣流中于240℃老化20 min，然后將經過老化的萃取頭插入頂空瓶中，于50℃條件下吸附45 min，吸附完成后迅速插入色譜儀進樣口，開始GC-MS檢測分析[12]。

氣相色譜-質譜聯用條件[13]：采用安捷倫DB-624弱極性毛細管柱分離揮發性物質，載氣為氮氣，流速1 mL/min，進樣口溫度為250℃;進樣方式為手動;分流比5∶1;升溫程序：50℃維持2 min，再以10℃/min升溫至200℃，離子源溫度：230℃;電離電壓：70 eV;質譜采用全掃描模式，速率3.5 scans/s;質譜范圍29～500 amu。

數據處理：深綠木霉HB20111樣品經過固相萃取后進行GC-MS分析鑒定，所得色譜和質譜信息采用安捷倫公司的質譜分析軟件進行分析，在NIST05/Wiley275標準譜圖庫進行檢索，選取化合物質譜數據庫中最小匹配度均大于80的成分，同時配合人工檢索、對照和解析，確認匹配化合物。利用面積歸一法計算各成分的相對百分含量。

1.3 深綠木霉HB20111產揮發性物質對病原菌的抑菌率

采用對扣法測定木霉產揮發性物質對病原菌的抑菌率，用5 mm滅菌打孔器分別打取已在PDA平板上活化兩次的深綠木霉HB20111和5株病原菌菌餅，用滅菌牙簽將其轉接于90 mm的PDA平板中間。將接有深綠木霉HB20111的PDA平板與接有病原真菌的PDA平板對扣起來，接有拮抗菌的一面朝上，用封口膜密封。同時設置對照組，只接病原真菌，不接拮抗菌。將上述平板放置于培養箱中，在（28±0.5）℃下培養。每個處理設3個重復。培養5 d后采用十字交叉法測量測試病原菌菌落直徑，計算抑菌率[14]。

抑菌率=

對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑對照病原菌菌落直徑-5×100%。

1.4 小麥幼苗形態指標測定

將小麥種子分為兩組，每組30粒置于發芽袋中萌發。發芽袋放入密閉的塑料盒中，其中一組塑料盒內放入培養5 d的開蓋的HB20111平板;對照組放置僅含培養基的空白平板，小麥萌發后7 d測定幼苗根長、株高和鮮重。用刻度尺測量30株小麥根長和株高，每株幼苗測量3根最長的根，計算各組的平均根長和株高;千分之一電子天平稱量每株鮮重;根冠比根據根系鮮重與地上部分鮮重的比值計算獲得。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜-質譜聯用鑒定深綠木霉HB20111有機揮發物質

深綠木霉HB20111樣品經GC-MS分析，從揮發性物質中共分離出56個離子峰，從中鑒定出53種化合物，用面積歸一化法確定了各揮發性物質的相對百分含量。鑒定的揮發性物質結果見表1，總離子流圖見圖1。

通過質譜分析，深綠木霉HB20111共鑒定53種揮發性物質。在這些揮發性物質中烷烴類5種，酯類4種，烯類17種，醇類5種，酮類4種，醛類2種，其他16種。其中烯類相對含量最高，為4968%、醇類為21.78%，酮類為8.56%，其余類別相對含量較低。在烯類中主要的揮發性物質有β-倍半水芹烯、α-姜油烯、β-水芹烯、雙表-α-雪松烯，其中β-倍半水芹烯和α-姜油烯分別為18.34%和13.53%，相對含量較高。除此之外，吡喃酮含量也相對較高，為784%，猜測這些成分應該是深綠木霉HB20111主要的功能性揮發物質。

2.2 深綠木霉HB20111產揮發性物質對病原菌的拮抗效果

由圖2可以看出，深綠木霉HB20111產生的揮發性物質對5種病原菌均有明顯的抑菌作用，但對不同病原菌的抑菌率不同（表2）。其中，對立枯絲核菌抑菌率最高，為50.62%;對假禾谷鐮孢的抑菌率最低，為16.00%。對層出鐮孢、尖鐮孢、麥根腐平臍蠕孢的抑菌率分別為32.73%、43.65%和44.00%。

2.3 深綠木霉HB20111產揮發性物質對小麥幼苗的促生作用

由圖3可以看出，深綠木霉HB20111產生的揮發性物質對小麥幼苗生長具有明顯的促生作用，處理小麥幼苗7 d后根長、株高、鮮重和根冠比分別為6.63 mm、5.60 mm、55.29 mg和0.72，與對照相比均有一定的促進作用，其中對小麥幼苗株高有顯著的促進作用（表3）。

3 討論

目前已從木霉中鑒定出至少480種VOCs，其中吡喃酮（6-戊基-2H-吡喃-2-酮，6PP）是從該真菌屬最早分離出來的揮發物之一[14-16]。木霉釋放的這些VOCs與其拮抗活性有關，有研究表明，它們可以抑制植物病原真菌的菌絲生長[17]。綠木霉T.virens和擬康氏木霉T.pseudokoningii所產揮發性有機物可以促進擬南芥側根的形成和生長[12，17-19];深綠木霉Tatroviride P1菌株除合成吡喃酮外還產生烷烴類、醇類、酮類、內酯、呋喃、單萜、倍半萜烯和C8化合物，其中1-辛-3-醇、3-辛醇、3-辛酮等是脂肪酸代謝的終產物[19]，認為可能是調控真菌發育和菌落間通訊的信號分子。

本研究中深綠木霉HB20111產揮發性物質中除吡喃酮外，還有大量的烯萜類物質，與已報道到的木霉產揮發性物質組成差異較大，其中β-倍半水芹烯、α-姜油烯、β-水芹烯、雙表-α-雪松烯均具有一定的生物學功能，如β-倍半水芹烯被認為具有與姜黃素相當的抗癌潛力[20]，在β-倍半水芹烯氧化酶和脫氫酶作用下可以生成β-姜黃酮，其具有抗脂質過氧化作用[21];β-水芹烯在低濃度時能增加細胞膜通透性，造成細胞質膜的不可逆損傷，進而導致細胞成分和鉀離子的泄漏[22-23];影響細菌的生物膜形成，對變異鏈球菌Streptococcus mutans、副溶血形弧菌Vibrio parahaemolyticus等具有抑制作用[24]，還有報道發現不同的黃皮精油組分中，富含β-水芹烯組分對多種念珠菌具有良好的抗真菌活性[25];主要成分為α-姜油烯（34.48%），β-倍半萜烯（22.90%）和α-姜黃素（16.17%）的精油具有抗微生物活性。革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對精油更敏感，同時該精油還具有抗氧化能力[26]。此外，在深綠木霉HB20111產揮發性物質中還含有2.98%的橙花叔醇，這是一種天然存在的倍半萜烯醇，存在于各種帶有花香的植物中，它是合成（3E）-4，8-dimethy-1，3，7-壬二烯（DMNT）的中間體，能夠吸引草食動物捕食者，從而保護植物免受草食動物損害[27]。

本研究表明，深綠木霉HB20111產揮發性物質對多種植物病原真菌具有明顯拮抗作用，同時對小麥幼苗有促生作用，其產生的揮發性物質中除廣為熟知的6PP成分外，還有功能性烯萜類揮發性物質，這些物質具有潛在的抗菌、抗氧化等功能，是我們今后需要進一步研究的內容。

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（責任編輯：楊明麗）