野生藥用植物內生真菌的分離及拮抗菌株篩選

楊帆 劉春來 劉亮 王爽 蔣希峰 李敏 曹大為 李新民

摘要 為挖掘生防新資源，采用組織分離法從21種野生藥用植物不同組織部位分離純化內生真菌，以6種植物病原菌為靶標菌篩選拮抗菌株，并根據形態學及分子生物學對菌株進行鑒定，在此基礎上研究了高效拮抗菌株對靶標菌菌絲生長及孢子萌發的影響。結果表明：從分離純化的478株內生真菌中篩選出11株高活性拮抗菌株，分屬于青霉屬Penicillium、平臍蠕孢屬Bipolaris、棘殼孢屬Pyrenochaeta、鐮孢屬Fusarium、粒毛盤菌屬Lachnum、墊殼孢屬Coniella和Neonectria 7個屬，其中青霉屬占比最高，達36.36%。平皿對峙試驗表明，

棘殼孢菌12-R-5對灰葡萄孢表現出高效性和專一性，其對菌絲抑制率達66.67%。含藥平皿試驗表明，菌株12-R-5發酵濾液10倍稀釋液對灰葡萄孢菌絲生長抑制率達100%，與其他處理差異顯著。菌株12-R-5 10倍發酵濾液處理灰葡萄孢10 h，孢子不萌發;100倍稀釋液處理對孢子萌發抑制率為91.01%。顯微鏡觀察發現，棘殼孢菌使灰葡萄孢菌絲扭曲變形，膨大腫脹及斷裂，部分菌絲發生縊縮、消融現象。說明棘殼孢菌12-R-5菌株具有很好的生防潛力及應用前景。

關鍵詞 藥用植物; 內生真菌; 植物病原菌; 拮抗作用

中圖分類號： S 572

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020499

Isolation of endophytic fungi from medicinal plants and screening for antagonistic strains

YANG Fan1，2，3， LIU Chunlai2，3， LIU Liang2，3， WANG Shuang2，3，

JIANG Xifeng2，3， LI Min2，3， CAO Dawei2，3， LI Xinmin1，2，3*

（1. Postdoctoral Research Workstation， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， China;

2. Institute of Plant Protection， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， China;

3. Scientific Observation and Experimental Station of Crop Pests in Harbin， Ministry of

Agriculture and Rural Affairs， Harbin 150086， China）

Abstract

In order to explore new biocontrol resources， endophytic fungi were isolated and purified from different tissues of 21 wild medicinal plants by using tissue isolation method. Antagonistic strains were screened against six common pathogenic fungi， and the strains were identified based on morphology and molecular biology. The effects of antagonistic strains against target pathogens on mycelial growth and spore germination were further studied. The results showed that 11 highly active antagonistic strains were screened out from 478 strains of endophytic fungi， which belonged to Penicillium， Bipolaris， Pyrenochaeta， Fusarium， Lachnum， Coniella and Neonectria. Penicillium accounted for the highest proportion， up to 36.36% of the total. The inhibition rate? of the strain 12-R-5 against Botrytis cinerea hyphae was 66.67% by the plate confrontation test. The inhibition rate of 10-fold fermentation filtrate of 12-R-5? against pathogen hyphae growth reached 100%， which was significantly higher than other treatments. Pathogen spores treated 10-fold the fermentation filtrates of the strain 12-R-5 for 10 h could not germinate. When the spores were treated with 100-fold diluent， the inhibition rate of spore germination was 91.01%. According to microscopic observation， the strain 12-R-5 could cause the hyphae of B.cinerea to expand and twist， and some hyphae shrunk and melted. The results indicated that the strain 12-R-5 had a good biocontrol potential and application prospect.

Key words

medicinal plants; endophytic fungi; phytopathogens; antagonistic activity

Petrini于1991年將內生菌定義為在其生活史中的某一段時期生活在植物組織內，且沒有引起植物組織明顯病害癥狀的微生物[1]。同時植物內生菌的挖掘被認為是尋找具有潛在農業、醫藥和工業應用價值的天然產物的新領域[2-3]。藥用植物是具有生物活性的天然化合物的豐富資源，且藥用植物內生真菌能夠產生與寄主植物相同或相似的活性成分[4-5]，而且在很大程度上仍未被開發[6]。因此從藥用植物中分離得到內生真菌在尋找新的生物活性天然化合物方面具有重要的應用價值。在殺菌劑的研制中內生真菌代謝產物具有很大的潛力。傳統藥用植物被認為是新型內生真菌的重要來源[7-9]。

本研究以采自大興安嶺東麓內蒙古自治區呼倫貝爾市阿榮旗三岔鎮新勝村處于營養生長階段的野生藥用植物為材料，采用組織分離法，進行內生真菌的分離、鑒定，從中篩選對植物病原菌拮抗作用較強的菌株，為挖掘野生植物內生真菌多樣性及功能型拮抗菌株篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試植物

供試植物材料于2017年7月底采自大興安嶺東麓內蒙古自治區呼倫貝爾市阿榮旗三岔河鎮新勝村，包括黃芩Scutellaria baicalensis、地丁草Corydalis bungeana、興安石竹Dianthus chinensis、玉竹Polygonatum odoratum、小葉玉竹Polygonatum humile、地榆Sanguisorba officinalis、威靈仙Clematis chinensis、關防風Saposhnikovia divaricata、藜蘆Veratrum nigrum、興安烏頭Aconitum ambiguum、毛筒玉竹Polygonatum inflatum、黃芪Astragalus mongholicus、毛百合Lilium dauricum、白蘚Dictamnus dasycarpus、蒼術 Atractylodes lancea、白芷Angelica dahurica、興安柴胡Bupleurum sibiricum、苦參Sophora flavescens、漏蘆Rhaponticum uniflorum、桔梗Platycodon grandiflorus、狼毒Euphorbia fischeriana，共21份野生植物樣本。

1.2 供試病原菌

供試病原真菌為：大豆根腐病菌Fusarium oxysporum、玉米大斑病菌Setosphaeria turcica、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani、水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani、玉米莖基腐病菌Fusarium graminearum，以上病原菌菌株由黑龍江省農業科學院植物保護研究所生物防治研究室保存。

1.3 供試植物中內生真菌分離及純化

采用組織分離法：植物樣品的根、莖、葉、花、果反復用自來水沖洗掉泥污，濾紙上晾干。取野生植物健康組織根、莖、果5～7 mm，葉、花3 mm見方。各組織經70%乙醇浸泡5 s，根、莖、果經0.1%升汞浸泡1.5～2 min，葉、花經0.1%升汞浸泡30～45 s，無菌水漂洗3次，滅菌濾紙吸干表面水分，接在含有鏈霉素（400 μg/mL）的PDA平皿上，每皿4塊組織，4次重復。于（25±1）℃培養箱中培養，每天觀察至有菌絲長出。

消毒效果驗證：取各組織最后1次無菌水沖洗液400 μL涂布于PDA平板，于（25±1）℃培養箱中黑暗培養3～5 d，觀察有無菌落產生，若平皿表面無真菌生長，則表明組織表面滅菌徹底，所分離獲得的是內生真菌，否則不能繼續用于試驗。

各組織培養2～3 d后，待培養組織邊緣有菌絲長出時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態不同的菌落轉移到新的PDA平皿繼續培養，反復純化并培養，對已純化的菌株編號，轉至PDA斜面培養基上，于（25±1）℃培養箱中培養5～7 d，4℃冰箱內保藏備用。

1.4 拮抗內生真菌初篩

采用平皿對峙培養法[10]，略改進。打取7 mm供試病原菌菌碟分別接在PDA平板中央，在距培養皿邊緣1 cm處等距對稱接種4株待測內生真菌菌碟，以單獨接種病原菌為對照，每處理重復3次。（25±1）℃培養箱培養至對照皿中病原菌長滿平皿，觀察待測內生真菌是否有拮抗作用，并測量抑菌帶寬。

1.5 拮抗內生真菌的鑒定

形態學鑒定：活化具有高效拮抗作用的菌株，取培養皿邊緣直徑7 mm菌碟，將菌碟轉接于PDA平板中央，（25±1）℃培養箱黑暗培養，每隔2 d觀察菌落形態，至菌絲長滿平皿時，顯微鏡下觀察菌絲、產孢結構以及分生孢子梗著生情況，對菌株進行初步鑒定。

分子生物學鑒定：利用通用引物ITS1和ITS4擴增菌株DNA，擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段經DNA膠回收試劑盒回收純化后送北京六合華大基因科技有限公司測序。將測序后獲得的序列提交到NCBI，用BLAST完成序列分析，結合形態學鑒定菌株。

1.6 高效拮抗菌株12-R-5對灰霉菌的影響

1.6.1 對病原菌菌絲的影響

對峙培養法。用直徑7 mm的打孔器分別在植物病原菌邊緣、待測菌株12-R-5平板上打取菌碟，在直徑90 mm PDA平板上取半徑3.5 cm的圓周，沿直徑對稱接種病原菌和菌株12-R-5菌碟各一塊，每處理重復3次。設只接種病原菌的平板為對照。置于（25±1）℃黑暗培養，待對照菌落長滿培養皿，直尺測量抑菌帶寬和處理組病原菌菌落半徑，計算菌絲生長抑制率（IMG）。

IMG=（對照菌落半徑-處理病原菌菌落半徑）/對照菌落半徑×100%。

瓊脂擴散培養法。在PDA平板中央接種植物病原菌菌碟，在菌碟周圍，按等邊三角形等距離放置牛津杯，每孔接入菌株12-R-5發酵濾液250 μL，每處理重復3次。以每孔接入無菌PDB培養液為對照。置于（25±1）℃培養箱黑暗培養，待對照菌落長滿培養皿，測量抑菌圈直徑。

含藥平皿法。用直徑7 mm打孔器在拮抗菌株的菌落邊緣打取菌碟，接種到150 mL PDB培養液中，每瓶3個菌碟，于（25±1）℃、180 r/min條件下振蕩培養7 d。將發酵液在5 000 r/min下離心15 min，收集上清液，用0.22 μm細菌過濾器過濾，獲得無菌發酵濾液，待用。待滅菌PDA培養基溫度降至40℃左右時與拮抗菌株發酵濾液按不同體積比混合均勻，制得含不同稀釋倍數（10、50、100、500倍和1 000倍）發酵濾液的平皿，將直徑7 mm的病原菌菌碟接種至平皿中央，以不含發酵液的PDA平板上接種的病原菌為對照，置于（25±1）℃培養箱中黑暗培養，待對照PDA平皿菌落長滿培養皿，十字交叉法測量各處理菌落直徑，計算菌絲生長抑制率（IMG）。

IMG=（對照菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.6.2 對病原菌孢子萌發的影響

收集在PDB中培養7 d的病原菌，4層無菌紗布過濾病原菌菌絲體，獲得病原菌孢子懸浮液，將菌株12-R-5發酵濾液與病原菌孢子懸浮液混合，得到稀釋10、50、100、500倍和1 000倍的發酵濾液5個處理，以病原菌孢子懸浮液為對照，每處理3次重復。將各處理孢子懸浮液裝入無菌試管中，置于（25±1）℃培養箱黑暗培養10 h檢測孢子萌發率，以芽管長度超過孢子一半長度為標準，判定孢子萌發。

1.7 統計分析

試驗數據采用SPSS數據處理系統進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗內生真菌初篩

試驗共分離、純化得到478株內生真菌，采用平皿對峙法測定分離菌株對6種靶標菌的抑菌作用，初篩獲得具有拮抗作用的菌株61株，其中對6種靶標菌抑菌帶寬≥5 mm的菌株有11株（表1）。

分離自地丁草果實的菌株2-Fr-8對6種病原菌菌絲生長均有較強的抑制作用，拮抗作用廣譜且高效，分離自黃芪根部的菌株12-R-5對番茄灰霉病菌具有專一性，且拮抗作用很強（圖1）。

2.2 拮抗內生真菌鑒定

通過NCBI進行BLAST比對，11株高效拮抗菌株分屬于青霉屬Penicillium、平臍蠕孢屬Bipolaris、棘殼孢屬Pyrenochaeta、鐮孢屬Fusarium、粒毛盤菌屬Lachnum、墊殼孢屬Coniella和Neonectria，共7個屬：青霉屬在7個屬中占比最高，達36.36%。

2.3 菌株12-R-5對灰葡萄孢的拮抗作用

2.3.1 12-R-5對灰葡萄孢菌絲生長的影響

經鑒定12-R-5為棘殼孢屬真菌。采用對峙培養法處理灰葡萄孢，可見邊緣菌絲稀少疏松（圖3a），菌株12-R-5對灰葡萄孢菌絲生長抑制率為（66.67±3.15）%。平板擴散培養法測定12-R-5發酵濾液對灰葡萄孢的抑制作用，發現牛津杯周邊幾乎不長菌絲，偶見稀少菌絲，抑菌直徑為（20.83±3.78）mm（圖3b）。在顯微鏡下觀察，對照菌絲生長細長而均勻，并無膨大、崩解、畸形現象（圖3c）。經發酵濾液處理的病原菌，菌絲生長受到嚴重的抑制，出現畸變現象，菌絲粗細不均，扭曲變形，膨大腫脹及斷裂（圖3d、e）。

在拮抗菌發酵濾液與PDA混合的平板上培養灰霉病菌，待對照PDA平皿上病原菌長滿時，各處理下病原菌菌落直徑有明顯差異（圖4）。發酵濾液稀釋10、50、100、500倍和1 000倍處理對病原菌菌絲生長抑制率分別為100%、89.14%、8234%、4524%和35.65%。

2.3.2 12-R-5發酵濾液對孢子萌發的影響

隨著稀釋倍數的增加，12-R-5對孢子萌發的抑制作用減弱。不同稀釋倍數的12-R-5發酵濾液處理灰葡萄孢孢子10 h后， 50、100、500倍和1 000倍發酵濾液對孢子的萌發抑制率分別為9340%、91.01%、78.63%和28.4%， 10倍稀釋液平皿下病原菌孢子不萌發，孢子萌發抑制率可達到100%。

3 結論與討論

自然界植物內生真菌種類多達100萬種[11]。因其特殊的生長環境以及和寄主長期協同進化，藥用植物內生菌可產生與寄主植物相同或相似的活性物質，成為了尋找和發現新穎而有價值的生物活性物質的研究熱點[12-13]。具有生物活性的微生物次生代謝產物可直接開發成為農用抗生素應用于農業病蟲害的防治[14]。目前已從沙冬青Ammopiptanthus mongolicus、老瓜頭Cynanchum mongolicum、甘草Glycyrrhiza uralensis、苦參Sophora flavescens、杜仲Eucommia ulmoides 、枸杞Lycium barbarum等多種藥用植物中獲得對植物病原菌有抑制作用的內生菌[15-17]。本研究從21種野生藥用植物中分離獲得478株內生真菌，篩選出對多種植物病原菌具有高效拮抗作用的內生真菌菌株11株，為研究開發新型生物農藥提供了豐富的生防微生物資源。

已報道的植物內生真菌絕大多數屬于子囊菌Ascomycetes，無孢菌群的多種真菌以及半知菌中的鏈格孢屬Alternaria、青霉屬Penicillium、鐮孢屬Fusarium真菌[18-19]。以藥用植物煙草Nicotiana tabacum為材料，分離獲得的539株內生真菌分屬于31個屬、73種，其中曲霉屬Aspergillus和鐮孢屬為優勢菌群[20]。從艾納香Blumea balsamifera的根、莖、葉中分離獲得的152株內生真菌具有豐富的物種多樣性，分屬于鐮孢屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬Trichoderma、彎孢屬Curvularia、脈孢菌屬Neurospora、多節孢屬Nodulisporium、間座殼屬Diaporthe、莖點霉屬Phoma、蠟質菌屬Ceriporia和煙管菌屬Bjerkandera 11個屬，其中鐮孢屬、曲霉屬、木霉屬和彎孢屬為艾納香內生真菌的優勢菌屬[21]。本研究篩選得到的11株高效拮抗菌株分屬于7個屬，其中青霉屬占36.36%，為優勢菌屬。

拮抗真菌抑菌機理主要體現在其具有較強的空間和營養競爭能力，能夠產生抑菌活性物質抑制植物病原菌的生長，或誘導植物產生抗病性等多方面[15]。據報道，杜仲Eucommia ulmoides內生真菌嗦孢殼屬Thielavia菌株DZGS08發酵液對玉米紋枯菌Rhizoctonia solani的抑制率達到50%以上[15]。分離自鳳丹Paeonia ostii 根部的一株鐮孢屬內生真菌對毛霉Mucor sp.、鏈格孢和青霉等6種病原菌抑制率均在80%以上[22]。枸杞內生真菌鐮孢屬菌株NQ8GII4對膠孢炭疽菌Colletotrichum Gloeosporioides的抑制率高達93.43%[16]。棘殼孢屬真菌作為感染人類皮膚、指甲的一類病原菌在醫學研究中普遍報道，同時該屬部分真菌以腐生菌的形式廣泛存在于熱帶和亞熱帶的土壤、植物中，部分真菌也會導致番茄、玉米根腐病的發生[23-24]，但未見棘殼孢屬真菌對植物病原菌具有拮抗作用的報道。本研究從野生黃芪根部篩選到的一株棘殼孢屬真菌12-R-5菌株，對灰葡萄孢菌絲生長及孢子萌發有顯著的抑制作用，并表現出高效專一性。有關菌株12-R-5的抑菌機理及其抑菌活性物有待深入研究，為研發微生物農藥提供依據。

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（責任編輯：楊明麗）