侵染青蒿的煙草曲莖病毒的分子鑒定及基因組結構特征分析

鐘靜 趙麗玲 李婷婷 丁銘

摘要 菜豆金色花葉病毒屬病毒是一類在全球熱帶及亞熱帶地區造成嚴重經濟損失的植物病毒，田間雜草是這類病毒重要的中間寄主。本研究從云南省玉溪市采集了表現黃脈的青蒿植株，通過PCR擴增、克隆及測序從樣品中獲得兩條菜豆金色花葉病毒屬病毒DNA-A全基因組序列，分別為YN6393-23和YN6393-27，其全長均為2 739 bp，相似性為100%。序列分析發現，YN6393-23和YN6393-27的核苷酸序列與煙草曲莖病毒Tobacco curly shoot virus（TbCSV）的分離物YN4584的核苷酸序列相似性最高，為99.45%。根據國際病毒分類委員會對菜豆金色花葉病毒屬病毒種的分類標準，全基因組序列相似性大于91%則為同種病毒，表明此病毒分離物為煙草曲莖病毒的一個分離物。這是菜豆金色花葉病毒屬病毒侵染青蒿植株的首次報道。

關鍵詞 青蒿; 煙草曲莖病毒; 雜草

中圖分類號： S 432.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020297

Molecular identification and genomic structural characteristics analysis of Tobacco curly shoot virus infecting Artemisia caruifolia

ZHONG Jing#， ZHAO Liling#， LI Tingting， DING Ming*

（Institute of Biotechnology and Germplasm Resources， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory

of Agricultural Biotechnology of Yunnan Province， Key Laboratory of the Southwestern Crop Gene Resources and

Germplasm Innovation， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Kunming 650223， China）

Abstract

Begomoviruses in the family of Geminiviridae have emerged as a major constraint on crop production in tropical and subtropical regions， and weeds can be the intermediate hosts of begomoviruses. Artemisia caruifolia samples with yellow vein symptom were collected in Yuxi， Yunan province. Among which， the DNA-A complete genome sequence of two isolates （YN6393-23 and YN6393-27） belong to Begomovirus? were obtained? by PCR， cloning and sequencing. The full length of two sequences was 2 739 bp， with the sequence identity of 100%. Sequence analysis showed that these begomoviruses sequences shared the highest identity （99.45%） with Tobacco curly shoot virus YN4584. Based on the ICTV criteria for Begomovirus species demarcation （≥91% sequence identity for the complete genome）， the virus was identified as an isolate of TbCSV. This is first report that Artemisia caruifolia plant can be infected by begemovirus.

Key words

Artemisia caruifolia; Tobacco curly shoot virus; weed

雙生病毒的病毒粒體為雙聯體結構，包裹著單分子或雙分子環狀單鏈DNA，DNA分子的長度在2.5～3.0 kb之間，雙生病毒主要侵染雙子葉植物，可危害棉花、木薯、番茄、煙草等多種經濟作物[1-4]。近年來，我國廣西、云南和海南等地陸續報道了多起因雙生病毒危害而造成的經濟損失事件，且雙生病毒的危害范圍及程度呈逐年上升的趨勢[5-6]。在雙生病毒科Geminiviridae的9個屬中，種類最多（包含320多個種）、分布最廣（亞洲、非洲及拉丁美洲等地均有分布）、危害最大的屬是菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus。從基因組結構上看，既有雙組分病毒又有單組分病毒是該屬病毒的一個典型特征，其中雙組分病毒的2個基因組大小相近，稱為DNA-A和DNA-B，單組分病毒屬病毒只含有DNA-A組分，一般編碼6～8個開放閱讀框（open reading frames，ORFs），包括病毒鏈編碼的V1和V2以及互補鏈編碼的C1、C2、C3和C4，并由一個基因間隔區（intergenic region，IR）分隔開，單組分病毒一般情況下常與beta衛星、alpha衛星以及一些缺陷型小分子DNA衛星形成病害復合體侵染寄主[7-8]。

重組是導致雙生病毒快速變異的主要原因。雜草寄主在菜豆金色花葉病毒屬病毒的重組與進化過程中起著重要的作用[9]。近年來，菜豆金色花葉病毒屬發現的病毒新種較多，其中很大一部分分離自雜草，如黃花稔曲葉病毒Sida leaf curl virus （SiLCV）、紫茉莉曲葉病毒Mirabilis leaf curl virus（MLCV）以及泰國一點紅黃脈病毒Emilia yellow vein Thailand virus（EYVTHV）等[10-12]，均是從不同雜草中鑒定到的菜豆金色花葉病毒屬病毒，這些在雜草中發現的病毒有可能侵染田間經濟作物。多年追蹤研究發現，很多雜草中發現的菜豆金色花葉病毒屬病毒不僅能侵染雜草，也能侵染經濟作物并造成經濟損失。1995年在新加坡勝紅薊（雜草）中首次分離到勝紅薊黃脈病毒Ageratum yellow vein virus（AYVV），2005年在日本發現其能夠侵染番茄，并造成嚴重經濟損失[13-14]。所以，雜草寄主對于菜豆金色花葉病毒屬病毒在不同寄主上的擴展非常重要，監測雜草上菜豆金色花葉病毒屬病毒的發生流行趨勢，對于防控作物上雙生病毒病害有重要的科學意義。

青蒿Artemisia caruifolia是菊科蒿屬植物，在我國吉林、陜西、山東、浙江、四川及云南等20多個省有分布，是常見的田間雜草，具有藥用價值，功效主要為消炎、止血[15]。本研究在云南省玉溪市采集了表現黃脈癥狀的青蒿植株，從中首次分離到煙草曲莖病毒，并對其全基因組序列特征及其進化和重組進行了系統分析。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2017年12月在對云南省玉溪市新平縣進行田間雙生病毒病害的調查中，發現部分田間雜草青蒿植株上表現出黃脈等疑似雙生病毒侵染引起的典型癥狀，隨機采集典型病株葉片（編號為YN6393），保存于-80℃。

1.2 植物總DNA提取

采用CTAB法[16]提取植物總DNA，DNA樣品使用超微量分光光度計進行質量檢測，將檢測合格的樣品進行PCR檢測或保存于-80℃備用。

1.3 菜豆金色花葉病毒屬病毒檢測

1.3.1 樣品PCR檢測

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒、beta衛星、alpha衛星相對應的通用引物PA/PB[17]、β01/β02[18]以及UNA101/UNA102[19]對樣品YN6393進行PCR檢測。引物相關信息見表1。

1.3.2 PCR檢測體系

PCR檢測體系（25 μL）：DNA模板0.5 μL、ddH2O 18.5 μL、含Mg2+的10×PCR反應緩沖液2.5 μL、2.5 mmol/L的dNTPs 2 μL、20 μmol/L的上、下游引物各05 μL、Taq Plus DNA聚合酶（5 U/μL， 上海申能博彩生物科技有限公司）0.5 μL。擴增條件：94℃預變性2 min;94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸45 s或90 s（其中采用PA/PB擴增延伸時間為45 s，采用β01/β02和UNA101/UNA102擴增延伸時間為90 s），32個循環;72℃延伸10 min。

1.3.3 PCR產物的回收、克隆及測序

PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將含有目的片段的膠塊在紫外燈照射下快速切割，利用Axygen DNA凝膠回收試劑盒回收，將回收產物連接到pGEM-T Easy（Promega， Madison， WI）載體上，連接產物通過熱激法轉入大腸桿菌DH5α中。將上一步產物均勻涂布于麥康凱培養基（MacConkey Agar，MAC），37℃倒置培養過夜，挑選陽性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

麥康凱培養基：明膠胰酶水解物17 g/L、胨（肉或酪蛋白）3 g/L、脫氧膽酸鈉1.5 g/L、氯化鈉5 g/L、乳糖10 g/L、結晶紫1 mg/L、中性紅30 mg/L以及瓊脂13.5 g/L。

1.4 菜豆金色花葉病毒屬病毒全基因組序列克隆

1.4.1 滾環擴增

通過滾環擴增（rolling circle amplification，RCA）能實現對靶核酸的信號放大，本研究用TempliphiTM RCA Kit進行滾環擴增。具體步驟為：將DNA模板（1 μL）與樣品緩沖液（5 μL）均勻混合，在95℃下變性3 min;隨后立即置冰上冰浴10 min;短暫離心后加入反應緩沖液（5 μL）和DNA聚合酶（0.2 μL），在30℃下反應18 h;在65℃下加熱10 min以終止反應。

1.4.2 PCR反應體系

用背靠背引物TbCSV-F/-R（表1）擴增菜豆金色花葉病毒屬病毒DNA-A全基因組。PCR反應體系（50 μL）：RCA模板0.5 μL、ddH2O 11.5 μL、含Mg2+的10×PCR反應緩沖液25 μL、2 mmol/L的dNTPs 10 μL、20 μmol/L的上、下游引物各1 μL、KOD FX DNA 聚合酶（1 U/μL，日本東洋紡株式會社）1 μL。擴增條件：98℃預變性2 min;98℃變性10 s，50℃退火30s，68℃延伸3 min，32個循環;68℃延伸10 min。

1.4.3 PCR產物的回收、克隆及測序

PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將含有目的片段的膠塊在紫外燈照射下快速切割，利用Axygen DNA凝膠回收試劑盒回收，將回收產物連接到pEASY-Blunt zero（北京全式金生物技術有限公司）載體上，連接產物通過熱激法轉入大腸桿菌DH5α中。將連接產物均勻涂布于麥康凱培養基，37℃倒置培養過夜，挑選陽性克隆，送英濰捷基（上海）貿易有限公司進行測序。

1.5 序列分析、進化樹構建及重組分析

菜豆金色花葉病毒屬病毒全長基因組核苷酸序列通過SeqMan（DNASTAR. Lasergene.v 7.1）進行拼接，通過DNAMAN 5.22和EditSeq（DNASTAR. Lasergene. v 7.1）進行開放閱讀框的尋找;通過BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov）和DNASTAR. Lasergene v 7.1進行核苷酸和氨基酸序列相似性比對;通過MEGA 5軟件[20]中的鄰接法（neighbor-joining）完成進化樹的構建，bootstrap值為1 000;通過RDP v.4.46軟件進行重組分析。

2 結果與分析

2.1 菜豆金色花葉病毒屬病毒檢測結果

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用引物（PA/PB）對表現黃脈的青蒿植株（YN6393）和健康青蒿植株（CK）總DNA進行PCR擴增，從YN6393總DNA中能夠擴增出一條約500 bp的特異性片段，而CK總DNA和雙蒸水空白對照均未出現特異性條帶（圖2）。將目的片段進行回收、克隆和測序，共獲得兩條序列（YN6393-49和YN6393-50），經BLAST與其他序列比較后發現，YN6393-49的核苷酸序列與煙草曲莖病毒云南分離物YN4501（KU663150.1）的部分核苷酸序列相似性最高，達到98.61%;YN6393-50的核苷酸序列與煙草曲莖病毒的云南分離物YN4524（KU663152.1）的部分核苷酸序列相似性最高，達到98.81%。結果表明，表現黃脈的青蒿樣品中檢測到菜豆金色花葉病毒屬病毒。

利用alpha衛星通用引物UNA101/UNA102及beta衛星通用引物β01/β02對表現黃脈的YN6393和CK總DNA進行PCR擴增，結果表明，YN6393、CK總DNA和雙蒸水空白對照均未擴增出特異性條帶。在表現黃脈的青蒿樣品中未檢測到beta衛星和alpha衛星。

2.2 菜豆金色花葉病毒屬病毒全長基因組序列擴增結果

菜豆金色花葉病毒屬病毒種的確定需要其全基因組序列，所以利用擴增TbCSV全基因組序列的特異引物對表現黃脈的青蒿植株（YN6393）和健康青蒿植株（CK）總DNA進行PCR擴增，結果從YN6393總DNA中能夠擴增出一條約2 700 bp的特異性片段，而CK總DNA和雙蒸水空白對照均未擴增出特異性條帶（圖2）。結果表明，從疑似樣品中擴增得到了菜豆金色花葉病毒屬病毒的全長序列。

2.3 菜豆金色花葉病毒屬病毒全長基因組結構分析

將2.2擴增得到的PCR產物進行回收、克隆，挑選陽性克隆進行測序。經過測序從青蒿樣品YN6393中得到兩條菜豆金色花葉病毒屬病毒全長基因組序列：YN6393-23和YN6393-27，DNA-A全長序列均為2 739 bp，兩條序列之間的核苷酸相似性為100%，選取其中一條序列（YN6393-23）進行其全基因組結構分析，并在GenBank上進行了登錄和注釋，序列登錄號：MT522159。與大部分菜豆金色花葉病毒屬病毒一樣，YN6393-23基因組結構具有菜豆金色花葉病毒屬中典型的單組分病毒的結構：含有一個保守的基因間隔區和6個開放閱讀框（ORFs），在病毒鏈上編碼V1和V2蛋白，在互補鏈上編碼C1、C2、C3以及C4蛋白，其具體位置如下：V1（294-1 064 nt），V2（134-490 nt），C1（1 513-2 598 nt），C2（1 206-1 610 nt），C3（1 060-1 465 nt），C4（2 148-2 570 nt），基因間隔區（IR）包含302 nt核苷酸，位置在2 571-2 739 nt和1-133 nt之間，其中包含有TATA box、保守的9核苷酸序列“TAATATT↓AC”以及重復序列“GGTCCT”。

2.4 菜豆金色花葉病毒屬病毒全長基因組序列相似性分析

將分離物YN6393-23與GenBank中的其他同屬的全長序列進行比對發現，其2 739 bp的核苷酸序列與TbCSV分離物YN4584（GenBank登錄號：MN481144）的核苷酸序列相似性最高，達9945%。根據該屬病毒的分類標準，不同種病毒的DNA-A全基因組核苷酸相似性小于91%，同種病毒不同分離物的DNA-A全基因組核苷酸相似性大于91%[21]，因此，分離物YN6393-23為煙草曲莖病毒的一個分離物，將其簡寫為TbCSV-YN6393-23。

將分離物TbCSV-YN6393-23與GenBank中相似性較高以及國內發生的菜豆金色花葉病毒屬病毒進一步比對發現，TbCSV-YN6393-23的IR區與TbCSV-YN2247分離物（GenBank登錄號：KX290925）核苷酸相似性最高（99.0%）;AV1與TbCSV-YN4530分離物（GenBank登錄號：KU934097）核苷酸相似性最高（99.6%）;AV2與TbCSV-YN4501分離物（GenBank登錄號：KU934094）和TYLCSbV-Y4536分離物（GenBank登錄號：NC_029995）核苷酸相似性最高（均為100%）;AC1與TbCSV-YN4584分離物（GenBank登錄號：MN481144）核苷酸相似性最高（994%）;AC2與TbCSV-YN2247、TbCSV-YN4584以及TbCSV-YN4519 3個分離物（GenBank登錄號：KX290925、MN481144、KU934095）核苷酸相似性最高（均為99.8%）;AC3與TbCSV-YN4584分離物（GenBank登錄號：MN481144）核苷酸相似性最高（998%）;AC4與TbCSV-YN2247、TbCSV-YN4584以及TbCSV-YN4519 3個分離物（GenBank登錄號：KX290925、MN481144、KU934095）核苷酸相似性最高（均為99.3%）。結果表明，TbCSV-YN6393-23分離物與云南獲得的其他離物在不同編碼區相似性均較高（表2）。

2.5 菜豆金色花葉病毒屬病毒全長基因組序列系統進化與重組分析

將TbCSV-YN6393-23與GenBank中其他菜豆金色花葉病毒屬病毒構建系統進化樹，結果發現，TbCSV-YN6393-23與TbCSV的不同分離物聚在一起形成一個大的分支，其中與TbCSV YN4584聚于一小支，說明TbCSV-YN6393-23與TbCSV YN4584親緣關系最近，該分離物是TbCSV的一個分離物（圖3）。這些菜豆金色花葉病毒屬病毒都是從云南分離獲得的，它們具有非常明顯的地理分布特征，即相同地域的TbCSV進化關系非常緊密。經過RDP重組分析發現，TbCSV-YN6393-23并無明顯的重組事件發生。

3 討論

菜豆金色花葉病毒屬病毒分布于熱帶及亞熱地區，為害多種經濟作物及雜草。近年來國際上對各種經濟作物上的菜豆金色花葉病毒屬病毒開展了廣泛的研究，取得了重要的進展[22-24]，而田間農作物周邊的雜草中也分離到不少菜豆金色花葉病毒屬病毒，并且雜草中此類病毒種類非常豐富，已報道有30多種雜草可被菜豆金色花葉病毒屬病毒侵染[25-29]。本研究從表現黃脈癥狀的田間雜草青蒿中通過分子生物學手段分離到兩條菜豆金色花葉病毒屬病毒的全基因組序列（YN6393-23和YN6393-27），分析發現，該分離物與TbCSV-YN4584相似性最高，且此分離物為菜豆金色花葉病毒屬典型的單組分病毒，不伴隨任何衛星分子，這是首次在青蒿上檢測到菜豆金色花葉病毒屬病毒。

進一步分析發現TbCSV-YN6393-23與其他分離自云南的TbCSV分物的相似性較高，親緣關系也較近;其中與TbCSV-YN2247的相似性較高（993%），而TbCSV-YN2247也是同樣分離自玉溪市新平縣，但是寄主為番茄。前期研究發現，田間雜草常常是菜豆金色花葉病毒屬病毒病害發生流行過程中的中間寄主，在菜豆金色花葉病毒屬病毒的侵染循環過程中起著重要的作用[28-30];在同一地區的經濟作物（番茄）和雜草（青蒿）上都鑒定到TbCSV，而且兩個分離物之間的相似性較高，表明青蒿很有可能作為TbCSV的中間寄主。在云南地區，青蒿是常見的田間雜草，在番茄種植區的田間地頭均有發生，所以青蒿可作為雙生病毒的中間寄主，通過煙粉虱傳播侵染其周邊經濟作物（番茄、辣椒、茄子等）。

TbCSV首次發現是在云南省保山市的煙草上，其全基因組序列于2000年在GenBank上進行登錄和注釋（登錄號：AF240675），并于2002年進行了報道[31]，此后該病毒便在云南省多個地區的不同寄主上發現，并造成一定的經濟損失。到目前為止，只在中國[32]、印度[33]、孟加拉國（登錄號：KM383757）以及緬甸（登錄號：MK920411）這4個亞洲國家報道過TbCSV。主要在茄科的番茄[34]、煙草[31]和辣椒[35]、豆科的菜豆[23]以及葫蘆科的西瓜[36]等作物上造成嚴重危害;而在雜草上，TbCSV能夠侵染錦葵科的賽葵Malvastrum coromandelianum[32]和黃花棯Sida acuta（登錄號：LC316184）、菊科的野向日葵Helianthus spp.[37]和勝紅薊Ageratum conyzoides[38]、紫茉莉科的紫茉莉Mirabilis jalapa[39]以及莧科的喜旱蓮子草Alternanthera philoxeroides（登錄號：GU199583），可見其寄主范圍非常廣泛。同屬菊科的青蒿、野向日葵和勝紅薊能夠被TbCSV侵染，而勝紅薊不但能被TbCSV侵染，也能被AYVCNV[11]、AYVV（登錄號：AF307861.1）、PaLCuCNV（登錄號：JX294075.1）以及勝紅薊耳突病毒Ageratum enation virus（AEV）[29]等菜豆金色花葉病毒屬病毒侵染，是一種易感菜豆金色花葉病毒屬病毒的植物。目前已報道有3種菊科植物能被TbCSV侵染，同屬菊科的金盞花Calendula officinalis[40]、紫莖澤蘭Ageratina adenophora[41]、豨薟Sigesbeckia orientalis[42]、鱧腸Eclipta prostrata[30]和一點紅Emilia sonchifolia[12]也都被證實能被菜豆金色花葉病毒屬病毒侵染;那么菊科植物中的萵筍、茼蒿、油麥菜、向日葵、非洲菊和蒲公英等具有經濟價值的植物是否也能被菜豆金色花葉病毒屬病毒侵染？所以對菊科植物上菜豆金色花葉病毒屬病毒的檢測及監測非常有必要。

雜草是雙生病毒重要的中間寄主，對這類病毒發生流行起到至關重要的作用。青蒿是我國各地田間常見雜草，其分布范圍相當廣泛，因此有必要對其感染的病毒種類進行調查與監測，其結果對防控該類病毒病害起到科學的指導作用。

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（責任編輯：楊明麗）