煙粉虱細胞色素CYP6EM1基因的克隆及對吡蟲啉抗性的作用

趙倩楠 黃明嬌 危學高 楊靜 杜田華 殷城 向文勝 楊鑫 張友軍

摘要 煙粉虱是一種世界性農業害蟲，其防治手段以化學防治為主，新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉常年用于防治煙粉虱，田間煙粉虱已經形成嚴重的抗藥性。本研究通過分析煙粉虱吡蟲啉抗性和敏感種群，發現細胞色素CYP6EM1基因在吡蟲啉抗性品系中上調了4.7倍，進而克隆了其全長基因，進行了熒光定量PCR分析，發現該基因在吡蟲啉抗性煙粉虱3齡若蟲期和雄蟲成蟲期過量表達，并且在抗性成蟲胸部和腹部過量表達。最后通過RNA干擾的方法使成蟲的CYP6EM1基因表達量下降了54.8%，之后發現當煙粉虱暴露于吡蟲啉時死亡率顯著升高了3965%，這表明CYP6EM1與煙粉虱對吡蟲啉抗性的形成相關。研究結果對于揭示煙粉虱對吡蟲啉產生抗性的機制有幫助，也為煙粉虱抗性水平田間監測及煙粉虱綜合治理提供理論依據。

關鍵詞 煙粉虱; 吡蟲啉; 細胞色素P450; RNA干擾

中圖分類號： S 481.4

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2020279

Cloning of cytochrome P450 gene CYP6EM1 and its function in imidacloprid resistance in whitefly， Bemisia tabaci

ZHAO Qiannan1， HUANG Mingjiao2， WEI Xuegao2， YANG Jing2， DU Tianhua2，YIN Cheng2， XIANG Wensheng1， YANG Xin2， ZHANG Youjun1，2*

（1. College of Life Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China; 2. Institute of Vegetables

and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Abstract

Whitefly， Bemisia tabaci， is a global harmful pest， and insecticides were widely used to control this pest. Imidacloprid， one of the neonicotinoid insecticides， has been used to control whitefly for many years. However， resistance to imidacloprid has been developed in field strains. In this study， the imidacloprid resistant and susceptible populations were compared， and a cytochrome P450 gene， CYP6EM1 was found to be over-expressed in resistant strain for 4.7 fold. The full length of CYP6EM1 was cloned and the mRNA expression level was analyzed by qRT-PCR. The results showed that CYP6EM1 was over-expressed in the third instar nymph and male adult of B.tabaci of imidacloprid resistance， and abound in thorax and abdomen of resistant adult. Moreover， the expression level of CYP6EM1 gene in adults was reduced by 54.8% by RNA interference. Then， it was found that the mortality of B.tabaci significantly increased by 39.65% when exposed to imidacloprid. This study is conducive to revealing the imidacloprid resistance mechanism of B.tabaci and provides a theoretical significance to determine the status of imidacloprid resistance in B.tabaci in the field and further establish the IPM strategies for whiteflies.

Key words

Bemisia tabaci; imidacloprid; cytochrome P450; RNA interference

煙粉虱Bemisia tabaci是一種世界性園藝害蟲，寄主植物廣泛，目前已經報道的寄主植物已經超過600多種，具有廣泛的植物適應性[1]。煙粉虱為害主要有三種途徑：直接吸食植物汁液使得植物生長緩慢，嚴重時萎蔫;分泌蜜露誘發煤污病影響植物光合作用;傳播植物病毒，特別是植物雙生病毒，導致大面積植株矮小，結實率降低甚至絕產，造成嚴重的經濟危害[2-4]。

煙粉虱的防治以化學防治為主，由于煙粉虱是一種刺吸性小型蔬菜害蟲，主要在植物葉片背部刺吸植物汁液，傳統的觸殺型殺蟲劑很難防治煙粉虱，而具有植物內吸性的新煙堿類殺蟲劑是防治煙粉虱等刺吸性害蟲的首選藥劑，對煙粉虱成蟲及若蟲均有很好的防效[5]。其中吡蟲啉作為第一代新煙堿類殺蟲劑廣泛用于防治煙粉虱，但是隨著吡蟲啉長期、大量的施用，導致了嚴重的抗藥性[5-8]。2007年在我國首次發現煙粉虱對吡蟲啉產生抗藥性;雖然北京和新疆的煙粉虱對吡蟲啉敏感，但是浙江、江蘇和湖北的煙粉虱對其產生了中到高水平的抗性，抗性倍數（抗性倍數=抗性種群的LC50/敏感參考種群的LC50）達到23～84倍[9]。2009年采集自江蘇省的煙粉虱對吡蟲啉表現出極高的抗性，抗性倍數達1 900倍[10]。大量的田間煙粉虱抗性水平監測結果表明，自然環境中的煙粉虱對吡蟲啉產生了嚴重的抗藥性[11]。

害蟲產生抗藥性的機制主要有兩種，分別為藥物靶標不敏感導致的靶標抗性和解毒酶過量表達導致的解毒抗性。靶標抗性的典型研究為褐飛虱乙酰膽堿受體突變（Y151）導致吡蟲啉在褐飛虱體內的結合能力減弱，從而形成抗藥性[12];另外田間蚜蟲乙酰膽堿受體突變（R81T）導致蚜蟲對吡蟲啉抗性水平顯著升高[13]。煙粉虱產生抗藥性的機制主要集中在解毒酶過量表達，尚未有靶標受體突變導致的抗藥性相關報道。例如CYP6CX1顯著高表達可能與福建省上街鎮的田間煙粉虱對氰戊酸酯、毒死蜱和阿維菌素的抗性相關[14]。田間煙粉虱對吡蟲啉產生抗性與2個細胞色素P450基因（CYP6CM1和CYP4C64）的表達量增加有關[15]。CYP6CM1基因過量表達，在B型煙粉虱和田間危害嚴重的Q型煙粉虱中形成抗藥性，它能將吡蟲啉代謝成毒力更低的羥基化吡蟲啉[15-17]。

前期研究發現當室內飼養的煙粉虱暴露于吡蟲啉時CYP6EM基因的表達水平提高[18]，但是否能在煙粉虱種群形成抗藥性尚不得知。基于煙粉虱基因組序列克隆獲得煙粉虱CYP6EM1基因的全長序列，通過熒光定量PCR分析了該基因在煙粉虱不同發育齡期和組織中的表達量，并且分析該基因在煙粉虱吡蟲啉抗敏品系中的表達量，最后通過RNA干擾技術研究了該基因在吡蟲啉抗性中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試煙粉虱

供試煙粉虱來自中國農業科學院蔬菜花卉研究所一直飼養的Q型煙粉虱種群，于溫室內飼養在棉花Gossypium herbaceum‘DP99B上，其中吡蟲啉敏感種群一直未接觸任何殺蟲劑，用吡蟲啉汰選獲得的抗性種群，其吡蟲啉抗性倍數約為42.5倍（表2）。溫室飼養條件為溫度（25±1）℃、相對濕度（70±5）%、光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 供試殺蟲劑

70%吡蟲啉水分散粒劑（WG），拜耳作物科學有限公司。

1.3 煙粉虱生物測定

煙粉虱成蟲生物測定采用浸液法，具體操作參考Feng等[19]的方法。吡蟲啉藥劑配制6個濃度，分別是50、100、200、400、800、1 600 mg/L和1組空白對照，每個濃度設置4個生物學重復，在蒸餾水中加入0.01%曲拉通，便于藥劑在葉片表面附著。指形管底部平鋪2%的液態瓊脂，待凝固后并且管壁水蒸氣晾干，同時用直徑22 mm的打孔器打取棉花葉片，每片浸藥10 s，待晾干后輕放于指形管的瓊脂上方，每管接入20～30頭煙粉虱，用棉塞封口。將整個裝置于培養箱（溫度25℃，光周期L∥D=14 h∥10 h）中倒置，48 h后檢測生測結果。

1.4 提取RNA及合成cDNA

用吸蟲管從養蟲籠中取50頭煙粉虱成蟲，液氮速凍5 min后用TRizol法提取RNA，利用分光光度計檢測樣品濃度以及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，并且參照TaKaRa反轉錄合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.5 克隆CYP6EM1基因及序列分析

CYP6EM1（BTA005348.1）基因全長通過煙粉虱基因組序列獲得，擴增引物CYP6EM1-F/R（表1）用Primer Premier 5.0 軟件設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以煙粉虱cDNA為模板，進行PCR反應，反應體系：1.0 μL cDNA，125 μL Taq酶 mix，10 μmol/L的上、下游引物各05 μL，105 μL ddH2O。PCR反應程序：95℃預變性 5 min;95℃變性 30 s，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個循環;72℃再延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物后將目的條帶切下，用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Promega）進行膠回收，連接回收產物到pEASY-T1克隆載體上，轉化到DH5α感受態細胞，進行藍白斑篩選，挑選陽性克隆，送北京擎科生物技術有限公司測序，在NCBI上比較分析測序結果。利用ExPASy翻譯工具Translate （http：∥web.expasy.org/translate/） 推斷蛋白序列。利用ExPASy蛋白組學工具Compute pI/Mw （http：∥ca.expasy.org/tools/pi_tool.html） 預測分子量（Mw） 和等電點（pI）。通過ClustalW[20]比對，利用MEGA 7.0的最大似然法，構建系統發育樹，bootstrap重復取樣次數為1 000，分析CYP6EM1基因在不同昆蟲間的進化關系。

1.6 分析CYP6EM1基因表達量

分別收集煙粉虱卵、1～4齡若蟲、雌性和雄性成蟲，每個齡期收集3個生物學重復，卵的1個生物學重復收集700粒，各個齡期若蟲的1個生物學重復收集100頭，成蟲的1個生物學重復收集50頭。再分別收集煙粉虱成蟲的頭部、胸部和腹部，每個部位收集3個生物學重復，頭的1個生物學重復收集500頭，胸和腹的1個生物學重復收集150頭。分別提取RNA，取1 μg總RNA反轉錄合成cDNA，用于研究CYP6EM1基因在吡蟲啉抗性煙粉虱不同齡期和組織的表達量。對于吡蟲啉抗性和敏感煙粉虱

種群，比較它們成蟲階段的差異。依據克隆獲得的CYP6EM1基因全長序列，設計熒光定量PCR（qRT-PCR）引物CYP6EM1-qF/-qR（表1），煙粉虱核糖體蛋白L29（ribosomal protein L29， RPL29）和延伸因子（elongation factors-1α，EF-1α）作為內參基因。qRT-PCR采用SYBR Green I染料進行，20 μL反應體系：1.0 μL cDNA模板，10 μL 2×SuperReal PreMix Plus， 10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，7.6 μL RNase-free ddH2O，0.4 μL 50×ROX Reference Dye。反應條件：95℃預變性10 min;95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。qRT-PCR引物的擴增效率通過3倍梯度稀釋的cDNA模板的Ct值來計算。根據2-ΔΔCt法計算在煙粉虱不同發育齡期和組織，以及吡蟲啉抗性和敏感種群之間CYP6EM1基因表達量的差異。

1.7 RNA干擾

通過設計合成dsCYP6EM1以及對照外源基因dsGFP，進行CYP6EM1的RNA干擾試驗。采用飼喂法進行煙粉虱的RNA干擾試驗[21]。48 h后取存活的煙粉虱進行qRT-PCR分析CYP6EM1基因的RNA干擾效率，確定該基因被干擾后進行吡蟲啉抗性水平的測定。每個飼喂室加入dsRNA飼喂液100 μL，CYP6EM1基因的dsRNA濃度為0.5 μg/μL。每個飼喂室放置煙粉虱40頭左右。每個處理有3個生物學重復，每生物學重復40頭左右煙粉虱。

1.8 數據分析

采用SPSS 19.0對試驗數據進行統計學分析，煙粉虱在不同發育齡期、不同組織和吡蟲啉抗敏種群之間的表達量差異采用單因素方差分析，差異顯著性分析應用Tukey法。通過POLO program PC PoloPlus對生物測定數據進行概率單位分析從而得到LC50值。

2 結果與分析

2.1 吡蟲啉抗性和敏感種群煙粉虱的生物測定

對吡蟲啉抗性和敏感種群的煙粉虱進行生物測定的結果如表2所示。

2.2 煙粉虱CYP6EM1基因的克隆及其序列分析

以煙粉虱cDNA作為模板，通過基因克隆獲得CYP6EM1基因的全長ORF序列，長度為1 539 bp，與基因組序列一致（基因組登錄號：BTA005348.1）。通過分析發現CYP6EM1基因可編碼512個氨基酸，等電點為6.33，分子量為58.95 kD。該蛋白具有細胞色素P450基因的保守結構域：Heme-binding結構域（P449-A459），Helix-C WXXXR結構域（W189-R193），Oxygen-binding結構域（A317-V322），以及Meander PXXFXP結構域（P426-P431），屬于典型的昆蟲P450基因。CYP6EM1基因的系統發育樹如圖1所示，Q型煙粉虱CYP6EM1基因編碼的氨基酸序列與煙粉虱P450家族CYP6亞家族基因聚類在一起。

2.3 在吡蟲啉抗性煙粉虱不同發育齡期和組織中CYP6EM1基因的表達水平

CYP6EM1基因在煙粉虱不同發育齡期的表達量可以通過熒光定量PCR分析，從圖2a可以看出，CYP6EM1基因在卵期表達量最低，在3齡若蟲期表達量稍高，在成蟲期的雄性成蟲中表達量最高，表明該基因在雄性煙粉虱中發揮作用。不同組織中的表達量如圖2b所示，該基因在煙粉虱頭部表達很少，在胸部和腹部表達較多。

2.4 CYP6EM1基因在吡蟲啉抗敏種群的表達量

通過qRT-PCR檢測在室內飼養的Q型敏感種群和吡蟲啉抗性種群中CYP6EM1基因表達量，發現該基因在吡蟲啉抗性種群中過量表達4.7倍（圖3a），差異極顯著，表明該基因過量表達可能參與煙粉虱對吡蟲啉的抗藥性。

2.5 RNA干擾試驗

由于CYP6EM1基因在煙粉虱吡蟲啉抗性種群中過量表達（圖3a），而對于該基因參與煙粉虱抗性形成的機制需要進一步的研究。通過飼喂0.5 μg/μL的dsCYP6EM1和dsGFP進行RNA干擾試驗，48 h后用熒光定量PCR檢測發現與飼喂dsGFP相比，飼喂dsCYP6EM1使得CYP6EM1基因在煙粉虱成蟲體內表達量減少了54.8%（圖3b）。進一步用100 mg/L的吡蟲啉進行RNAi后的生物測定，24 h后發現與飼喂dsGFP相比，飼喂dsCYP6EM1后煙粉虱的死亡率顯著增加（圖3c）。結果表明RNA干擾降低CYP6EM1基因表達量能顯著降低煙粉虱對吡蟲啉的抗性。

3 討論

20世紀90年代以來，煙粉虱開始入侵我國形成危害，特別是2003年發現的Q型煙粉虱入侵我國以后，造成了嚴重的危害，隨之而來的番茄黃化曲葉病也大規模暴發，導致番茄等重要農作物大量減產，甚至絕產[22]。防治煙粉虱主要使用新煙堿類殺蟲劑，第一代新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉被廣泛用于防治煙粉虱。但是嚴重的抗藥性導致藥物的使用量增加，防效顯著降低，對于煙粉虱抗藥性的研究顯得十分重要。

前期研究報道表明細胞色素P450基因在煙粉虱對吡蟲啉抗性中發揮重要作用，特別是關鍵基因CYP6CM1的克隆[15]，功能解析[18]，以及一系列的田間樣品檢測[17]，發現該基因在煙粉虱對吡蟲啉的抗性形成中發揮重要作用。最近關于該基因在煙粉虱體內的調控機制也得到揭示，研究結果表明轉錄因子CREB和MAPK信號通路參與了該基因的調控過程，也參與了吡蟲啉抗性的形成[23]。而除此之外，關于煙粉虱對于吡蟲啉抗性的其他解毒酶機制報道很少，最新研究表明解毒代謝相關基因如谷胱甘肽轉移酶基因，ABC家族基因也可能參與了煙粉虱對吡蟲啉抗性的形成[24-25]。由細胞色素P450單加氧酶上調表達導致的代謝解毒能力增強是昆蟲產生抗藥性的重要機制。通過對轉基因果蠅的研究發現，CYP6M2和CYP6P3的過表達與岡比亞按蚊Anopheles gambiae對噁蟲威的抗性相關，CYP6P3表達的蛋白可以代謝噁蟲威[26]。CYP6ER1的表達量上調（上調36.87倍）在褐飛虱Nilaparvata lugens對氟啶蟲胺腈的抗性中發揮了重要作用[27]。與敏感品系相比，CYP346B1、CYP346B2和CYP346B3均在赤擬谷盜Tribolium castaneum磷化氫抗性品系中過表達，CYP346B亞家族基因與其對磷化氫抗性相關[28]。CYP6CY3過表達參與了桃蚜Myzus persicae對新煙堿類殺蟲劑抗性的形成[29]。在果蠅中，CYP6G1的過表達增加了其對吡蟲啉和DDT大約10倍的抗性[30]。在家蠅Musca domestica中，CYP6A1、CYP6D1和CYP6D3的過表達與其對新煙堿抗性相關[31]。

本研究通過對吡蟲啉抗性和敏感種群的分析，發現一個新的P450基因CYP6EM1在煙粉虱吡蟲啉抗性種群中過量表達，依托Q型煙粉虱基因組序列對該基因的全長進行了克隆分析，發現該基因屬于昆蟲P450基因家族。進一步分析CYP6EM1基因在煙粉虱不同發育齡期和組織的表達水平，發現該基因可能與煙粉虱雄性成蟲的生理功能有關，并且是在胸部和腹部過量表達，表明該基因可能參與了煙粉虱中腸解毒過程。通過RNAi敲除該基因后，發現隨著CYP6EM1基因表達量的降低，煙粉虱對吡蟲啉的抗性水平也顯著降低，表明該基因可能參與煙粉虱對吡蟲啉抗藥性的形成。下一步將解析該基因對吡蟲啉的代謝能力，通過體外表達該基因的蛋白，進行體外代謝確定其代謝能力，從而闡明煙粉虱CYP6EM1基因在吡蟲啉抗性中的作用。

關于煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑的抗性機制研究現在仍然處于大量挖掘抗性基因的階段，特別是田間抗性形成機制復雜，一系列與煙粉虱抗藥性相關的研究方向都需要從分子層面進行解析，所以通過抗藥性機制的大量研究，為解決煙粉虱抗藥性提供思路，也為高效防治煙粉虱提供理論依據。

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（責任編輯：田 喆）