甘蔗白葉病抗病性鑒定方法的建立與應用

李文鳳 王曉燕 倉曉燕 單紅麗 王長秘 張榮躍 尹炯 黃應昆

摘要 為建立簡便高效、致病性穩定和規范實用的甘蔗抗白葉病鑒定方法，推動甘蔗抗白葉病育種，本文從甘蔗材料處理與種植、接種液配制、接種方式、病情調查、分級標準制定等層面對甘蔗抗白葉病鑒定技術進行了系統研究與探索，首次優化創建了簡便高效、致病性穩定和規范實用的甘蔗抗白葉病鑒定方法，即種苗噴霧接種法和生長期切莖接種法。種苗噴霧接種法：直接篩選甘蔗白葉病植原體蔗莖榨汁加10倍量無菌水配制接種液，接種液噴灑蔗種，塑料薄膜保濕，接種材料桶栽置于防蟲溫室培養，接種種植30 d開始調查病株率，按1～5級標準進行抗病性評價。切莖接種法：直接篩選甘蔗白葉病植原體蔗莖榨汁加10倍量無菌水配制接種液，鑒定材料桶栽置于防蟲溫室培養，株齡6月時切莖用移液槍將100 μL接種液滴入根部切口接種，接種種植20 d開始調查病株率，按1～5級標準進行抗病性評價。兩種方法與自然傳播相似，接種后發病顯著、靈敏度高、重現性好，抗性鑒定結果與田間自然發病相吻合。通過兩種接種方法和田間自然發病調查，鑒定明確了10個主栽品種對甘蔗白葉病抗病性，其抗病性真實、可靠，可作為今后甘蔗抗白葉病鑒定標準品種。

關鍵詞 甘蔗白葉病; 接種技術; 種苗噴霧接種法; 切莖接種法; 抗病鑒定

中圖分類號： S 435.661

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020313

Establishment and application of the resistance identification method for sugarcane white leaf disease

LI Wenfeng#， WANG Xiaoyan#， CANG Xiaoyan， SHAN Hongli， WANG Changmi，

ZHANG Rongyue， YIN Jiong， Huang Yingkun*

（Sugarcane Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Yunnan Province Key

Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement， Kaiyuan 661699， China）

Abstract

This study aims to establish a simple and efficient， standardized and practical resistance identification method with stable pathogenicity for sugarcane white leaf disease （SCWL）， and then promote resistance breeding. The resistance identification technology of SCWL was systematically investigated and explored from the aspects of treatment and planting of sugarcane varieties， inoculum preparation， inoculation method， disease investigation and formulation of grading standard. The simple and efficient， stable in pathogenicity， standardized and practical resistance identification method of SCWL namely seedcane-spraying inoculation method and stem-cutting inoculation method during growth period were optimized and established for the first time. The seedcane-spraying inoculation method was established on directly screening the sugarcane stem juice contained SCWL phytoplasma and adding 10-fold of sterile water to prepare the inoculum， spraying with the inoculum to the seedcane on the plastic film to keep moisture， planting the inoculated materials in the pot and cultivating in the insect-proof greenhouse， starting to investigate the disease incidence after 30 days of inoculation and planting， and evaluating the disease resistance according to the 1-5 grade standards. The stem-cutting inoculation method was established on directly screening the sugarcane stem juice contained SCWL phytoplasma and adding 10-fold of sterile water to prepare the inoculum， planting the tested materials in the pot and cultivating in the insect-proof greenhouse， using a pipette to drop 100 μL inoculum into the cut section of the six month old stem， starting to investigate the disease incidence after 20 days of inoculation and planting， and evaluating the disease resistance according to the 1-5 grade standards. These two inoculation methods were similar to the natural transmission， and the incidence was obvious after inoculation， the sensitivity was high， the reproducibility was good， and the resistance identified result was consistent with the natural incidence in the field. Through two methods and natural disease investigation in the field， the SCWL resistance of 10 main cultivated varieties was identified， and their resistance was true and reliable， which could be used as the SCWL resistance identification standard varieties in the future.

Key words

sugarcane white leaf disease; inoculation technology; seedcane-spraying inoculation method; stem-cutting inoculation method; resistance identification

甘蔗白葉病（sugarcane white leaf， SCWL）是由16Sr XI組植原體引起的危險性甘蔗重要病害[1-2]。此病1954年首次在泰國發現[3]，現已廣泛發生于印度、巴基斯坦、斯里蘭卡、日本、老撾、緬甸、越南、菲律賓等東南亞國家，給當地造成巨大經濟損失[4-7]。2013年Li等[8]首次檢測確定云南保山蔗區存在SCWL，隨后云南臨滄和普洱蔗區也相繼發現SCWL[9-11]。SCWL擴散蔓延十分迅速，嚴重威脅著我國甘蔗生產和發展。

SCWL的癥狀主要表現為葉質柔軟、白化，分蘗明顯增多，植株矮縮，節間縮短，頂部葉片叢生。甘蔗感染SCWL植原體后，株高、莖粗、有效莖數和單莖重量顯著減少，導致甘蔗產量和糖分損失嚴重[2]。SCWL植原體主要通過帶病蔗種進行遠距離傳播，在田間還可通過葉蟬自然傳播[2， 6]。田間調查結果表明，不同品種植期田間自然發病率不同[12]。SCWL發生受品種抗性，種蔗帶毒率、傳毒蟲媒葉蟬數量及環境條件等諸因素影響。如品種高度感病，種蔗帶毒率高，加上環境條件有利于介體昆蟲繁殖和傳毒活動，則SCWL發生重[2]。

選育和推廣抗病品種是防控甘蔗病害最經濟有效的方法[2]，也是最具潛力的綠色生態防控技術，而抗病性鑒定方法直接影響抗病育種成效。甘蔗白葉病是近年快速發展起來的新病害，引起甘蔗白葉病的植原體是無細胞壁原核微生物，尚不能采用人工培養基離體培養[2]，至今國內外在甘蔗抗白葉病鑒定方面研究甚少、尚未建立甘蔗白葉病抗性鑒定方法。如何準確高效評價甘蔗品種的白葉病抗病性是目前甘蔗育種家選育抗病品種面臨的一個技術瓶頸。鑒于我國甘蔗白葉病蔓延擴展和日趨加重態勢，急需研究建立一套簡便高效、致病性穩定和規范實用的甘蔗白葉病抗性鑒定方法，以推動甘蔗抗白葉病育種。

1 材料與方法

1.1 供試甘蔗品種

選取‘粵糖60號‘新臺糖25號‘盈育91-59‘粵糖93-159‘新臺糖22號‘云蔗86-161‘云蔗03-194‘新臺糖10號‘柳城05-136‘云蔗05-51共10個主栽品種作供試品種，以‘粵糖86-368作感病對照，‘粵糖83-88作抗病對照。

1.2 接種病原及接種液配制

從云南省臨滄耿馬縣甘蔗白葉病發病區域選擇具典型白葉病癥狀的高感品種‘粵糖86-368蔗株，按文獻[13]中的方法經巢式PCR檢測篩選含甘蔗白葉病植原體的蔗莖作接種病原。接種前壓榨作接種病原的蔗莖獲得攜帶甘蔗白葉病植原體蔗汁，加入10倍體積的無菌水稀釋混勻，用雙層紗布過濾，濾液即為甘蔗白葉病植原體接種液，現配現用。

1.3 鑒定方法

1.3.1 種苗噴霧接種法

材料處理：各供試品種按文獻[13]中的方法經巢式PCR檢測篩選不帶甘蔗白葉病植原體的無病健壯蔗株，分別切成帶2個芽的甘蔗莖段（即雙芽段），在常溫流動自來水中浸泡48 h之后，用50℃±0.5℃熱水處理2 h，再用70%噻蟲嗪水分散劑和50%多菌靈可濕性粉劑1∶800倍液浸泡甘蔗莖段10 min。

種苗噴霧接種：將處理好的蔗種晾干表面水分后置于塑料膜表面，采用電動噴霧器按1 000 kg處理好的蔗種用15 kg接種液的比例，將接種液均勻噴灑置于塑料膜表面的蔗種，邊噴邊翻動蔗種，噴完后將該塑料膜的一半覆蓋蔗種，并在25℃下保濕24 h。

材料種植：接種后的供試品種分別種植在直徑35 cm、高30 cm的塑料桶內，桶內裝入2/3的高溫蒸煮消毒土壤和有機質（3∶1），各供試品種種植4桶，每桶8芽，共32芽，置于云南省農業科學院甘蔗研究所（云南開遠）的20～30℃抗病蟲鑒定防蟲溫室中培養。

病情調查：接種種植30 d后，各供試品種標記20株調查發病株率，以后每隔15 d調查1次，直至感病對照品種發病株率穩定為止。記錄接種日期、出苗數、病害癥狀始現期、累計發病株數。

分級標準：根據各供試品種發病株率進行抗性水平分類，劃分為1～5級，分別表示高抗、抗病、中抗、感病和高感，其發病株率范圍相應為0～3%、31%～10%、10.1%～20%、20.1%～40%和401%～100%。

1.3.2 切莖接種法

材料處理和種植與1.3.1相同。

切莖接種：供試品種6個月株齡時，在陰天的傍晚用滅菌鋒利切刀（或枝剪）把供試材料植株地上部分沿土表快速切去，再用移液槍將 100 μL甘蔗白葉病植原體病原接種液滴入蔗株根部切口上，每個品種接種20株，遮光24 h。接種后繼續置于20～30℃抗病蟲鑒定防蟲溫室中培養。

病情調查：接種種植20 d后，各供試品種標記20株接種株，調查發病株率，以后每隔15 d調查1次，直至感病對照品種發病株率穩定為止。記錄接種日期、出苗數、病害癥狀始現期、累計發病株數。

病害分級標準同1.3.1。

1.3.3 田間自然發病調查

于5月甘蔗白葉病發病穩定后，對云南發病最重的耿馬芒翁蔗區各供試品種進行田間自然發病調查。調查地塊各品種新植下種時間為當年2月、收砍留養宿根時間為當年2月，種植行距均為1 m，旱地，磚紅壤，pH 6.0，有機質含量2.5%，肥力中等，水肥管理及甘蔗長勢均勻一致。各品種隨機選擇3塊地，每塊地隨機選擇3個點，每點連續調查100株，共300株，記錄發病株數。自然發病株率=（病株數/總調查株數）×100%。病害分級標準同13.1。

2 結果與分析

由表1可以看出，兩種接種方法10個供試主栽品種和1個感病、1個抗病對照品種發病株率略有差異，其抗病等級和抗病性結果完全一致;且兩種接種方法對各供試品種的抗性鑒定結果與田間自然發病情況相吻合，說明兩種接種方法鑒定結果均能真實反映甘蔗品種的自然抗感性。

種苗噴霧接種法：‘粵糖60號‘新臺糖25號‘盈育91-59‘粵糖93-159‘新臺糖22號‘云蔗86-161‘云蔗03-194‘新臺糖10號‘柳城05-136病害癥狀始現期分別為30、30、30、30、30、45、45、60、60 d;切莖接種法：‘粵糖60號‘新臺糖25號‘盈育91-59‘粵糖93-159‘新臺糖22號‘云蔗86-161‘云蔗03-194‘新臺糖10號‘柳城05-136‘云蔗05-51病害癥狀始現期分別為20、20、20、20、20、35、35、50、50、50 d。

根據各供試品種材料發病株率按1～5級分級進行抗性水平分類，其中：‘粵糖60號‘新臺糖25號‘盈育91-59表現為5級高感，‘粵糖93-159‘新臺糖22號表現為4級感病，‘云蔗86-161表現為3級中抗，‘云蔗03-194‘新臺糖10號表現為2級抗病，‘柳城05-136‘云蔗05-51表現為1級高抗（表1）。

3 結論與討論

甘蔗白葉病是近年快速發展起來的植原體新病害，至今尚未建立甘蔗白葉病抗性鑒定方法[2]。如何準確高效評價甘蔗品種的白葉病抗性是目前甘蔗育種研究者選育抗病品種面臨的一個技術瓶頸。為此，云南省農業科學院甘蔗研究所在前期調查研究基礎上，從甘蔗材料處理與種植、接種液配制、接種方式、病情調查、分級標準制定等層面對甘蔗抗白葉病鑒定技術進行了系統性研究與探索，首次優化創建了兩套簡便高效、致病性穩定和規范實用的甘蔗白葉病抗性鑒定方法，即種苗噴霧接種法和生長期切莖接種法，為我國甘蔗抗白葉病育種提供了關鍵技術支撐。利用兩種鑒定方法可實現對甘蔗優異種質資源、常用雜交親本及新品種（系）抗白葉病的快速、準確評價，將切實提高抗白葉病育種的可靠性和選育效率，對于抗白葉病種質資源篩選和生產用種選擇具有重大意義和現實作用。

兩種接種方法各供試品種的抗性鑒定結果與田間自然發病情況相吻合[9， 12]，均能真實反映甘蔗品種材料的自然抗感性。種苗噴霧接種法通過病原接種液噴灑蔗種塑料薄膜包衣接種，具備和滿足甘蔗白葉病侵染發病生境條件，能直觀表現出甘蔗品種對甘蔗白葉病抗性水平。切莖接種法與自然傳播相似，鑒定結果更接近于田間自然感病結果，制造的傷口均勻，接種病原量一致，發病均勻。兩種接種方法接種液不用分離培養，直接從田間采集制備;接種方法快速簡便，可操作性強;接種后甘蔗白葉病發病顯著、靈敏度高、重復性好，鑒定結果可靠。因此，方便對大批量材料進行鑒定和篩選，為育種和生產部門提供更多更廣泛的抗病品種和抗源材料。

本研究通過兩種接種方法和田間自然發病調查，鑒定明確了10個主栽品種對甘蔗白葉病抗病性，其抗病性真實、可靠，可作為今后甘蔗抗白葉病鑒定標準品種。

參考文獻

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（責任編輯：田 喆）