CaCl2作用下核誘導形成乳清蛋白纖維聚合物特性研究

徐紅華 郭芮池 謝明明 馬彩虹 陳 穎 劉玉琪

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

乳清作為生產奶酪的副產品長久以來被人們充分利用[1-2]。乳清蛋白在改善食品的性質、提高食品質量等方面具有重要作用[3-4]。乳清蛋白在低pH值、低離子強度、長時間高溫加熱條件下能夠形成納米纖維聚合物[5-6]。這種纖維聚合物是一種長的、半柔性的淀粉狀纖維，具有常規聚合物不具備的優良特性，在起泡性、乳化性等方面性質良好[7-8]。乳清蛋白纖維聚合物可以通過自發和核誘導2種方式自組裝形成，但是，蛋白質纖維聚合物的形成受離子強度的影響很大，一般鹽的加入會改變其組裝路徑進而導致形成能力喪失[9-10]，這也是其應用受到限制的主要原因。核的形成主要來自乳清蛋白組裝初期形成的具有晶體結構的低聚物(均相核)和最終的成熟纖維(二次核)[11-12]。針對乳清蛋白纖維聚合物只能在低離子條件下形成的缺陷[13-14]，本文研究乳清蛋白組裝聚合物界面性質，通過改變CaCl2濃度分析核誘導方式下形成的纖維聚合物能夠耐受的離子強度，通過分析功能性質改變所產生的纖維組裝結構變化，探究CaCl2對核形成(第1階段)、核誘導(第2階段)、纖維聚合物(第3階段)界面性質(乳化性、起泡性)的變化，同時研究CaCl2對乳清蛋白聚合量動力學、纖維生成量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

乳清濃縮蛋白WPC-80，美國HILMAR公司;CaCl2，純度99.99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;硫黃素T，Sigma公司;其他化學試劑均為分析純。

1.2 樣品制備

1.2.1均相核與二次核制備

乳清濃縮蛋白(WPC)：參照文獻[15-16],取5.00 g乳清濃縮蛋白粉(WPC-80)溶于去離子水中，使用6 mol/L和1 mol/L HCl調pH值至2.0并用pH值2.0的水(事先用6 mol/L HCl調節pH值)定容至100 mL，16 000g離心20 min(4℃)，取中層清液，凱氏定氮測定蛋白質含量，用pH值2.0的去離子水稀釋至質量分數3.0%，4℃冰箱保存。

均相核：參照文獻[17-18]，上述pH值2.0、質量分數3.0%的WPC在90℃水浴加熱2 h，4℃冰箱保存。

二次核：參照文獻[19]，上述pH值2.0、質量分數3.0%的WPC在90℃水浴加熱10 h，4℃冰箱保存。

1.2.2納米纖維制備

自發：質量分數3.0%的WPC(pH值2.0)于90℃水浴加熱10 h，取樣并于4℃冰箱保存。

均相核誘導：將上述均相核與質量分數3.0%的WPC(pH值2.0)以體積比1∶3混合均勻，90℃水浴加熱10 h，取樣并于4℃冰箱保存。

二次核誘導：將上述二次核與質量分數3.0%的WPC(pH值2.0)以體積比1∶3混合均勻，90℃水浴加熱10 h，取樣并于4℃冰箱保存。

空白樣品的制備：為了消除核自身與WPC原料結構的差異，將1.2.1節形成的WPC、均相核、二次核分別與pH值2.0的水以體積比1∶3混合均勻，90℃水浴加熱10 h，取樣并于4℃冰箱保存。后續測定的各項指標均減去空白樣的相應值。

1.3 CaCl2對核形成的影響

為了探究CaCl2對核形成的影響，在乳清蛋白原料中加入不同離子強度的CaCl2制備核，并進行核誘導，判斷在CaCl2作用下形成的核是否具有誘導形成正常纖維的能力。

CaCl2對均相核形成的影響:取pH值2.0、質量分數3.0%的WPC 28 mL添加2 mL濃度0.15、0.3、0.75 mol/L的CaCl2使溶液中CaCl2濃度分別為0、20、50 mmol/L，蛋白最終質量分數為2.86%，混合均勻后90℃水浴加熱2 h，4℃冰箱保存。

CaCl2對二次核形成的影響: 取pH值2.0、質量分數3.0% 的WPC 28 mL添加2 mL濃度0.15、0.3、0.75 mol/L的CaCl2，使溶液中CaCl2濃度分別為0、20、50 mmol/L，蛋白最終質量分數為2.86%，混合均勻后90℃水浴加熱10 h，4℃冰箱保存。

之后將上述在CaCl2作用下形成的均相核、二次核與質量分數3.0%的WPC(pH值2.0)以體積比1∶3混合均勻，90℃水浴加熱10 h，取樣并于4℃冰箱保存。

空白樣品的制備：將上述在CaCl2作用下形成的均相核、二次核與pH值2.0去離子水以體積比1∶3混合均勻，以保證核濃度相同，90℃水浴加熱10 h，取樣并于4℃冰箱保存。

1.4 CaCl2對核誘導能力的影響

為了探究CaCl2對核誘導的影響，核形成之后加入不同離子強度的CaCl2，通過核誘導制備纖維，與不加CaCl2的自發相比判斷CaCl2對核誘導的影響。

CaCl2對均相核誘導能力的影響：pH值2.0、質量分數3.0%的 WPC均相核與質量分數3.0% WPC以體積比1∶3混合均勻，取28 mL上述蛋白樣品添加2 mL CaCl2使溶液中CaCl2濃度分別為0、20、50 mmol/L，蛋白最終質量分數均為2.86%，90℃水浴加熱2 h，取樣并于4℃冰箱保存。

CaCl2對二次核誘導能力的影響: pH值2.0、質量分數3.0%的WPC均相核、二次核與質量分數3.0%的WPC以體積比1∶3混合均勻，取28 mL上述蛋白樣品添加2 mL濃度0.15、0.3、0.75 mol/L的CaCl2使溶液中CaCl2濃度分別為0、20、50 mmol/L，蛋白最終質量分數均為2.86%，90℃水浴加熱10 h，取樣并于4℃冰箱保存。

空白樣品的制備：WPC、均相核、二次核分別與去離子水(pH值 2.0)以體積比1∶3混合，取28 mL混合樣品添加2 mL濃度0.15、0.3、0.75 mol/L的CaCl2使溶液中CaCl2濃度分別為0、20、50 mmol/L，90℃水浴加熱10 h，取樣并于4℃冰箱保存。

1.5 界面性質

為探究在不同階段添加CaCl2對納米纖維聚合物功能性質的影響，測定了在CaCl2作用下形成的核誘導WPC、在誘導過程中添加CaCl2、在纖維成熟后添加CaCl2的自發、均相核誘導、二次核誘導的起泡性與乳化性，樣品均為熱處理10 h，CaCl2濃度為0、20、50 mmol/L。

1.5.1起泡性

參照文獻[20-21]并加以改進，用pH值7.0的去離子水將蛋白質量分數稀釋至0.15%，室溫(20℃)下均質1 min(10 000 r/min)后測定泡沫的體積，并記錄靜置至泡沫消泡至原體積一半的時間。通過相對溢出量和靜止后穩定的泡沫體積比測定樣品的起泡能力和泡沫穩定性指數，具體計算方法為

FC=V0/Vi×100%

(1)

FS=t1/2

(2)

式中FC——起泡能力,%

FS——泡沫穩定性指數，min

V0——起泡0 h時的泡沫體積

Vi——起泡前最初液體的體積

t1/2——消泡至V0/2的時間，min

FCWPC=FC-FC0

(3)

FSWPC=t-t0

(4)

式中FCWPC——被誘導WPC的起泡能力,%

FC0——對應空白樣品的起泡能力,%

FSWPC——被誘導WPC的泡沫穩定性指數，min

t——樣品的泡沫穩定性指數，min

t0——對應空白樣品的泡沫穩定性指數，min

1.5.2乳化性

參照文獻[22]的方法并加以改進，用pH值2.0的去離子水稀釋樣品至質量分數1.0%，取30 mL的樣品加入10 mL大豆油，室溫下用高速勻漿機20 000 r/min下均質3 min，立即取底部乳狀液30 μL加入5 mL質量分數0.1%的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液中，在500 nm處測定吸光度，以質量分數0.1%的SDS為空白調零，乳化活性指數和乳化穩定性指數計算公式為

EAI=2×2.303/[C(1-φ)×104]A500×100

(5)

(6)

式中EAI——乳化活性指數，m2/g

ESI——乳化穩定性指數，%

C——蛋白質質量濃度，g/mL

A500——溶液在500 nm下的吸光度

φ——大豆油占乳化液的體積分數，取25%

At——乳化液靜置20 min時的吸光度

A0——乳化液靜置0 min時的吸光度

EAIWPC=EAI-EAI0

(7)

ESIWPC=ESI-ESI0

(8)

式中EAIWPC——被誘導WPC的乳化活性指數，m2/g

EAI0——對應空白樣品的乳化活性指數，m2/g

ESIWPC——被誘導WPC的乳化穩定性指數，%

ESI0——對應空白樣品的乳化穩定性指數，%

1.6 Th T熒光強度

參照文獻[23]的方法并加以改進，取0.80 g甲硫磺素T(Th T)溶于0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.0)，并定容至1 000 mL。用水系0.22 μm濾膜過濾，所得濾液即為Th T儲備液。測定時使用Th T工作液，即儲備液含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.0)稀釋50倍。儲備液與工作液均存放在冰箱4℃避光棕色瓶內。取800 μL樣品加入10 mL的Th T工作液中，旋渦振蕩1 min后，于熒光分光光度計下比色。設定參數為：激發波長為460 nm，發射波長為490 nm，狹縫寬度分別為5 nm和10 nm，測定不同加熱時間下樣品的熒光強度公式為

ThTWPC=ThT-ThT0

(9)

式中ThTWPC——被誘導的WPC的Th T熒光強度

ThT——樣品的Th T熒光強度

ThT0——對應空白樣品的Th T熒光強度

被誘導的WPC每小時熒光強度變化量為誘導t+1 h的熒光強度減去誘導t的熒光強度。

1.7 蛋白聚合率

取20 mL樣液于50 mL離心管中，15 000g、4℃離心30 min，取上層清液，利用凱氏定氮法測定蛋白含量，計算公式為

C′=Ct/C0×100%

(10)

式中C′——蛋白聚合率，%

C0——初始樣品蛋白質質量濃度，mg/mL

Ct——t時未聚合蛋白質質量濃度，mg/mL

核誘導過程中核自身也會發生變化，本試驗中為去除核自身的影響，研究被誘導的WPC蛋白聚合率的變化，因此需要減去空白樣品的蛋白聚合率，公式為

C′WPC=C′-C′0

(11)

式中C′WPC——被誘導的WPC蛋白聚合率

C′0——對應空白樣品的蛋白聚合率

1.8 蛋白質聚合速率

利用1.7節中的數據結果和非線性回歸速率公式計算自發、均相核誘導、二次核誘導在形成纖維過程中加入不同濃度CaCl2的動力學參數公式為

-df/dt=knCn

(12)

式中 df/dt——每小時熒光強度變化量，h-1

n取1。在一定的加熱時間t后，蛋白形成聚合物通過離心沉淀聚合物，上清液中蛋白質量濃度由C0下降至Ct(g/L)，活化能滿足公式

(13)

Ea=-RTlnk+C

(14)

(15)

式中k——反應速率常數(蛋白質聚合速率)

Ea——反應的活化能

R——氣體常數，取8.314 J/(mol·K)

T——熱力學溫度

1.9 數據統計分析

所有試驗均重復3次。采用SPSS 16.0軟件進行方差分析(ANOVA)，檢驗差異顯著性(P<0.05)，結果均用平均值±標準差表示，使用Excel 2010軟件制圖。

2 結果與討論

2.1 乳化性

采用核誘導方式制備乳清蛋白納米纖維，整個過程分為3個階段：第1階段核形成時期；第2階段核誘導時期；第3階段纖維聚合物已形成時期[24-25]。CaCl2在不同階段混入對纖維聚合物的形成可能有不同影響，通過乳化性能的差異推斷可能產生的結構差異。從圖1(圖中不同大寫字母表示組間差異顯著，不同小寫字母表示組內差異顯著，下同)可以看出，未添加CaCl2時核誘導的乳化活性高于自發，其中二次核誘導高于均相核誘導。添加CaCl2時，乳清蛋白通過自發方式形成纖維聚合物的乳化活性無明顯變化，對于核誘導方式而言，核形成時期(第1階段)添加CaCl2會降低其乳化活性，但在核誘導期以及纖維形成之后(第2、3階段)則無影響，且乳化活性優于自發方式。

對其乳化穩定性而言，未添加CaCl2時核誘導的乳化穩定性高于自發，其中二次核誘導高于均相核誘導。在核形成時期(第1階段)添加CaCl2，其乳化穩定性降低程度高于自發方式；與第1階段不同，核誘導階段(第2階段)添加CaCl2，核誘導方式比自發方式表現出更好的乳化穩定性能，二次核誘導更為突出，CaCl2濃度為50 mmol/L時，均相核誘導、二次核誘導乳清蛋白形成的纖維聚合物較自發方式樣品乳化穩定性指數分別降低了30.92%、34.09%；對于纖維已經形成的第3階段添加CaCl2的樣品乳化穩定性無明顯變化。

2.2 起泡性

起泡能力如圖2所示，未添加CaCl2時，核誘導的起泡能力高于自發，其中二次核誘導高于均相核誘導。在核形成時期(第1階段)添加CaCl2時，自發樣品的起泡能力無明顯變化，核誘導樣品的起泡能力明顯低于自發樣品；其中二次核誘導樣品較均相核誘導樣品的起泡能力相比略低，且起泡能力隨CaCl2濃度變化較小。第2、3階段添加CaCl2樣品的起泡能力分別與對照樣相比無明顯變化。

泡沫穩定性如圖2所示，第1階段添加CaCl2時破壞了纖維核的形成，使其不能正常形成纖維聚合結構，表現出對CaCl2的耐受性差，導致樣品的泡沫穩定性均低于自發方式樣品，且隨CaCl2濃度的增加而降低；第2階段添加CaCl2時，纖維核已經形成，誘導乳清蛋白形成纖維聚合物的過程中對CaCl2耐受性強于自發樣品，導致樣品的泡沫穩定性比自發樣品高，且隨CaCl2濃度的增加而增加，在添加50 mmol/L CaCl2時，均相核誘導、二次核誘導泡沫穩定性指數分別降低了68.18%、78.59%。第3階段添加CaCl2時纖維已經形成，CaCl2對纖維無影響，導致樣品的泡沫穩定性變化不大。

2.3 Th T熒光分析

2.3.1核形成

通過測定樣品的Th T熒光強度，判斷在CaCl2作用下形成的核是否具有誘導形成正常纖維的能力[26-27]。硫黃素(Th T)是一種熒光染料，可特異性與纖維β-折疊結構相結合，可側面反映纖維的數量[28-29]。由圖3可知，CaCl2對核的形成有影響，CaCl2對均相核與二次核的形成影響有所不同，2種核喪失誘導能力的程度不同。

在低CaCl2濃度下，自發的熒光強度大于核誘導，且均相核大于二次核；證明在該條件下核的形成受到破壞，喪失誘導能力。在高CaCl2濃度下，自發的熒光強度大于核誘導，且均相核大于二次核； CaCl2濃度越高破壞能力越強。

2.3.2核誘導過程纖維量

如圖4所示，未加CaCl2時，自發的熒光強度低于2種核誘導，且二次核誘導高于均相核誘導，2種核誘導可增加纖維量。2種核在20 mmol/L的CaCl2濃度下，核誘導樣品的熒光強度高于自發樣品，均相核、二次核仍具有誘導能力，且二次核誘導高于均相核誘導。在50 mmol/L的CaCl2濃度下時，自發、均相核誘導、二次核樣品較對照組樣品的熒光強度均減少，分別減少了23.14%、28.43%、26.91%，說明在誘導過程中CaCl2降低核誘導能力，破壞纖維結構，但熒光強度上依舊保持著核誘導高于自發、二次核高于均相核的規律。

為探究核誘導在添加不同濃度CaCl2后核誘導能力的差異，用添加CaCl2的二次核樣品的Th T熒光強度與不加CaCl2的樣品作差，ThT熒光強度下降27.55%。添加CaCl2的樣品Th T熒光強度減小，均相核誘導與二次核誘導在低CaCl2濃度下其Th T熒光強度依舊高于自發，說明依然具有誘導能力；高CaCl2濃度下其Th T熒光強度下降，誘導能力喪失。此結果表明核誘導過程中加入鹽離子會破壞纖維結構的形成。

綜上，纖維核通過自發方式形成時對CaCl2的耐受能力差，這也說明鹽離子對乳清蛋白自組裝形成纖維聚合物的破壞主要是影響核的形成；相反，一旦纖維核已經形成，相比自發方式，核誘導方式更能夠在一定的鹽離子條件下誘導乳清蛋白形成纖維聚合物。

2.4 蛋白質聚合能力

2.4.1蛋白質聚合率

如圖5所示，延長加熱時間，不同樣品的未聚合量均呈現下降趨勢，3種樣品隨CaCl2濃度增加，未聚合量逐漸降低，表明延長熱處理時間和提高CaCl2濃度會促進蛋白質之間聚合形成大分子聚合物。纖維形成過程主要分為3個階段，滯后期(0～2 h)、指數增長期(2～5 h)、成熟期(5～10 h)。與自發手段不同，核誘導的聚合量在滯后期增長較快，而自發在指數增長期同樣增長迅速。在滯后期CaCl2對聚合速率的影響尤為明顯，加入CaCl2會顯著提高樣品的聚合速率，且隨CaCl2濃度升高提高幅度越大。

2.4.2蛋白質聚合速率

自發、均相核誘導、二次核誘導添加CaCl2后熱處理形成纖維聚合物的聚合動力學參數存在一定差異(見表1)。未添加CaCl2時，均相核與二次核誘導的聚合速率高于自發，分別是自發的1.44與1.61倍，二次核誘導的聚合速率最大，核誘導的活化能低于自發，說明核誘導更容易達到活化狀態，更易聚合形成纖維。添加CaCl2可明顯提高自發和核誘導2種纖維聚合方式的聚合速率，降低活化能，改變幅度隨離子濃度的增加而增大。在CaCl2濃度為50 mmol/L時，自發、均相核誘導、二次核誘導其聚合速率較其對照樣(未加CaCl2樣品)分別提高了41.98%、45.75%、44.49%。通過聚合量動力學參數可知，CaCl2的加入可促進聚合反應，加快聚合速率，降低活化能。文獻[30-31]研究同樣也指出向蛋白中添加纖維核就是引入了有序的區域，這導致了酸水解形成的肽段可以直接吸附到均相核上，從而導致滯后期縮短，加快了纖維形成速率。由于核誘導形成纖維的聚合速率高于自發方式，加入CaCl2產生的這種聚合動力學的變化可能對核誘導聚合形成纖維的影響更小。

表1 自發、均相核誘導、二次核誘導添加CaCl2后熱處理聚合動力學參數Tab.1 Polymerization kinetic parameters for spontaneous, homogeneous nucleation-induction and secondary nucleation-induction addition of CaCl2 after heat treatment

3 結論

(1)核形成過程中(第1階段)加入CaCl2能破壞核的形成，使核的誘導能力喪失，因此乳化活性、乳化穩定性、起泡能力和泡沫穩定性降低，CaCl2濃度增加，對核形成的破壞作用加劇。

(2)核誘導過程中(第2階段)加入CaCl2纖維形成量雖然下降，但與自發方式相比，核誘導方式對CaCl2的耐受能力相對更強，纖維形成量更多，界面性質更優。

(3)纖維形成后(第3階段)加入CaCl2對纖維結構無破壞作用，對其界面性質也無顯著影響。

(4)加入CaCl2對核的形成以及核誘導過程的破壞作用，可能主要來自CaCl2能夠提高蛋白質的聚合速率，降低反應的活化能，這種快速聚合破壞了乳清蛋白形成纖維的有序組裝過程。但是，由于核誘導自身組裝聚合的速率高于自發方式，CaCl2產生的這種聚合動力學的變化可能對核誘導聚合形成纖維的影響更小。