維生素D干預四氧嘧啶誘導兔糖尿病骨髓脂肪含量的定量MRI分析研究

閆玉辰，查云飛

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種全身慢性代謝性疾病，在體內高糖刺激下，骨髓微環境改變，促使骨髓間葉組織向脂肪組織轉化，抑制成骨細胞形成，導致骨髓內脂肪堆積[1]。骨髓脂肪細胞是骨髓造血微環境和能量代謝的調節器，糖尿病脂肪堆積和脂質代謝紊亂會導致骨髓脂肪生成增加及骨髓細胞組成的改變[2]，骨髓微環境平衡失調，與骨質疏松癥和脆性骨折的風險等改變密切相關[3]，是臨床上糖尿病患者致死、致殘的主要原因[4]。

維生素D是一種脂溶性物質，對于脂肪的分化有著調節作用[5]；其儲存和代謝的主要場所位于脂肪組織，糖尿病肥胖患者會使得血清1-25 (OH)D3不足[6]。維生素D對于調節骨髓微環境，可改善骨髓脂肪堆積及促進骨強度[7]；有研究表明維生素D 的補充可以限制糖尿病患者皮下脂肪的再增加，但對于已生成的脂肪組織尚無改善作用，并且能促進胰島素釋放、改善胰島素的抵抗[8]；同時，維生素D刺激皮下脂肪細胞活化，加快體內葡萄糖的攝取，改善循環血糖濃度，對于維持體內鈣、磷平衡及骨微環境代謝穩態有調節作用[5，9]。

定量非對稱回波的最小二乘估算法迭代水脂分離序列(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation quantitation sequence，IDEAL-IQ)結合了快速三維多回波梯度回波成像序列和增強的圖像重建技術改善了局部脂肪的檢出，通過數據模型重建、整合水和脂肪多回波的復數數據來估算器官內脂肪含量(fat fraction，FF)[10-11]。IDEAL-IQ 序列掃描具有簡單、快速、重復性好等特點，其中在后處理工作站上可直接計算出腰椎感興趣區骨髓脂肪含量百分比，為在活體糖尿病骨髓脂肪含量改變的定量研究中表現出了巨大臨床價值[12-13]。同樣使用IDEAL-IQ 技術，胡磊等[14]前期研究結果顯示糖尿病兔腰椎體骨髓內脂肪含量較正常組明顯增多。目前尚未見維生素D 干預糖尿病骨髓脂肪含量的影像學研究報道，本研究旨在探討IDEAL-IQ 技術下評價維生素D對于糖尿病骨髓脂肪含量改變的價值。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備

本實驗研究從2019 年8 月開始，2020 年12 月結束，武漢大學人民醫院倫理委員會審查通過所有實驗(第20190421號)。30只28～32周齡健康日本雄性大耳白兔，體質量3.0～3.5 kg，由武漢大學動物實驗中心提供單籠飼養，室溫25 ℃，30 只兔適應期間自由攝食、進水，于一周后測得血糖均在正常范圍[(5.5±0.5) mmol/L]。

30 只日本雄性大耳白兔按隨機分為兩組，其中實驗組20 只；造模前，將四氧嘧啶(Sigma 公司)配制成5%溶液，30 只兔均禁食8～12 h，不禁水；造模時，由耳緣靜脈按照100 mg/kg 快速注射入實驗組兔體內，對照組10 只給予注射同等量生理鹽水。造模后每小時用血糖儀(三諾安信血糖儀)測量耳緣末梢血糖，自由進食；對于血糖＜2.0 mmol/L 或出現嚴重低血糖表現的大白兔，如抽搐、尖叫、精神不振、不進食等表現，通過給予注射葡萄糖緩解。四氧嘧啶注射48 h 后重新測量實驗兔末梢血糖濃度，其中測得血糖值大于14 mmol/L 或不同時間點血糖值大于11 mmol/L，可認定造模成功[15]；若測得血糖處在正常范圍內，則補加50 mg/kg四氧嘧啶，直至血糖水平達標；對于血糖水平超過30 mmol/L的嚴重高血糖水平，通過皮下注射長效胰島素，將其控制在30 mmol/L以下。

四氧嘧啶造模成功一周后，隨機將20 只實驗兔再分為兩組；其中，干預組10 只每周口服維生素D (400 μg)，連續給藥4 周；對照組和單純糖尿病組每周用生理鹽水10 mL灌胃。

1.2 MRI設備及成像方法

所有兔在第0、4、8、12、16周的時間點，分別從耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉溶液(3%，2 mL/kg)麻醉，在3.0 T Discovery MR750 Plus 磁共振設備(GE Healthcare)上，固定于8 通道膝關節專用相控陣線圈，擺放體位呈仰臥位、足先進；使用常規腰椎矢狀位FSE-T2WI、FSE-T1WI及腰椎IDEAL-IQ掃描。

矢狀位T1WI 掃描參數：TR 300 ms，TE Min Full，掃描層厚3 mm，視野16 cm×16 cm，矩陣320×288，激勵次數為2，掃描時間2 min 6 s。矢狀位T2WI 掃描參數：TR 2500 ms，TE 120.0 ms，掃描層厚3 mm，視野16 cm×16 cm，矩陣320×320，激勵次數為4，掃描時間2 min 45 s。矢狀位IDEAL-IQ 掃描參數：翻轉角6°，TR 17.2 ms，TE 1.2、3.2、5.2、7.2、9.2、11.2 ms。帶寬31.25 kHz，掃描層厚3 mm，視野18 cm×0.8 cm，矩陣192×160，激勵次數為3，掃描時間5 min 37 s。

1.3 兔腰椎IDEAL-IQ骨髓脂肪含量百分比測定

在AW4.6 后處理工作站上(GE Healthcare)，將對照組、單純糖尿病組及維生素D 干預組所有兔的IDEAL-IQ 掃描圖像導入，選取3 組各個時間點Fat Fraction 圖像中兔腰椎第5～7 椎體中心層面，由同一觀察者勾畫感興趣，每1 個椎體的ROI 要避開椎體終板軟骨、邊緣骨皮質的干擾，重復3 次，取平均值。見圖1。

圖1 A～C 分別為矢狀位T1WI、T2WI、FF 圖。紅色區域為勾畫的腰7 椎體(白色箭頭)興趣區Fig.1 A—C showed the T1WI,T2WI,FF,respectively.The red area was the ROIarea of fat fraction of the 7th lumbar vertebra(white arrow).

1.4 兔腰椎骨髓組織病理學檢查

完成檢查后，在第16 周采取空氣栓塞法處死所有實驗兔，取腰5、6、7椎體作為病理標本，10%多聚甲醛固定組織，脫鈣兩周后用石蠟包埋，垂直于椎體蠟塊短軸位作4 μm 切片，行HE 染色。隨機選取3 個相互不連續的區域，由同一觀察者分別于顯微鏡高倍鏡(×400)視野下統計脂肪細胞數目，取平均值。

1.5 統計學分析

采用統計學軟件SPSS 23.0，對第0、4、8、12 及16 周各時間點IDEAL-IQ 測量所得的3 組間腰椎體骨髓脂肪含量，其中空白對照組、單純糖尿病組、維生素D 干預組各采用兩兩重復測量的方差分析統計。第16 周IDEAL-IQ 測量腰椎體脂肪含量FF 與HE 染色切片鏡下脂肪細胞計數采用Pearson 相關分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

因麻醉意外在實驗期間實驗組共死亡7 只，其中單純糖尿病組剩余6 只，維生素D 干預組剩余7 只，對照組死亡1 只，空氣栓塞處死2只，剩余7只。

IDEAL-IQ 測量單純糖尿病組及維生素D 干預組各組組內在造模后第16 周椎體骨髓脂肪含量FF 值較第0 周明顯增高，且兩時間點測得FF 值具有統計學意義(F=4.971，P＜0.05；F=3.055，P＜0.01)，兩 組其他時間點測得FF 值不具有統計學意義(P＞0.05)；對照組椎體各時間點骨髓脂肪含量百分比差異無統計學意義(P＞0.05)(圖2)。

圖2 空白對照組、單純糖尿病組、維生素D 干預組各時間點IDEAL-IQ椎體脂肪比的趨勢圖Fig.2 Trend chart of the proportion of vertebral bone marrow fat measured by IDEA-IQ at each time point between the simple diabetes group,vitamin D intervention group and control group.

單純糖尿病組及維生素D 干預組兩組第16 周椎體IDEAL-IQ 測量脂肪含量百分比與第16 周對照組比較，腰椎骨髓FF%差異分別存在統計學意義(P＜0.05)。但是，同一時間點糖尿病組與維生素D 干預組組間在第16 周的FF 值差異不具有統計學意義(t=2.390，P=0.06)(表1)。

表1 單純糖尿病組、維生素D干預組、對照組各時間點IDEAL-IQ椎體脂肪比的比較(%)Tab.1 Comparison of IDEAL-IQ values at each time point between the simple diabetes group,vitamin D intervention group and control group(%)

第16周，腰椎骨髓HE染色顯示單純糖尿病組與維生素D干預組中骨髓脂肪細胞較空白對照組相比明顯增多、增大(圖3)；空白對照組、單純糖尿病組與維生素D干預組骨髓脂肪細胞數目平均值分別為12.80±5.26/mm2、21.30±6.80/mm2、19.20±5.81/mm2，單 純糖尿病組與維生素D 干預組骨髓脂肪細胞數值高于空白 對照 組(t=-19.549，P＜0.05；t=-15.681，P＜0.05)，差異有統計學意義。但維生素D 干預前后，兩實驗組骨髓脂肪細胞數值差異無明顯統計學意義(t=-0.481，P=0.412)。

圖3 A～C 分別為第16 周空白對照組、單純糖尿病組、維生素D 干預組兔腰椎骨髓HE 染色(×400)。黑色箭頭所指為脂肪細胞Fig.3 A—C showed HE staining of lumbar bone marrow of rabbits in the control group,the simple diabetes group and the vitamin D intervention group at week 16 (×400).The black arrows indicate adipocyte.

Pearson相關性分析結果顯示兔糖尿病模型成功后第16周，實驗兔腰椎骨髓脂肪含量(FF)值與HE染色后的脂肪數目呈正相關(r=0.828，P＜0.05)(圖4)。

圖4 四氧嘧啶誘導兔糖尿病模型后第16 周，實驗兔腰椎骨髓FF 值與脂肪數目呈正相關Fig.4 FF values of lumbar bone marrow was positively correlated with the number of adipocyte at the 16th week in alloxan-induced diabetic rabbits.

3 討論

本實驗探討基于IDEAL-IQ 技術評估維生素D 干預前后糖尿病骨髓脂肪含量變化，研究結果表明，在第16 周單純糖尿病組和維生素D 干預組骨髓脂肪含量較對照組脂肪含量增高，其中單純糖尿病組增高較為明顯；第16 周維生素D 干預組組較第16 周單純糖尿病的脂肪含量差異無相關性，但維生素D干預下骨髓脂肪分數值整體呈下降趨勢。

多種MRI 定量技術在評價骨髓脂肪含量方面具有獨特優勢，磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy，MRS)檢測是一種通過充分利用化合物間的差別而無創性的光譜觀察檢測生物體活體組織中的各種組織新陳代謝、生化變化和對其化合物進行定量檢測的科學技術[16]。Li 等[17]研究結果表明3.0 T MRS 對于低骨密度個體的椎體骨髓脂肪含量的測定具有可行性；但是，1H-MRS 技術難點是骨髓磁場譜圖曲線的線寬易直接受到松質骨髓的小梁和骨髓磁場不均勻的因素影響，且掃描時間長，要求較高、后處理較為復雜而受到限制。水和脂肪的回波不對稱迭代分解和最小二乘估計量化序列(IDEAL-IQ)作為一種新的MR 圖像脂肪含量百分比的量化方法，該方法已被用于估計多個器官的脂肪含量[10]。相對于1H-MRS，IDEAL-IQ 技術具有用時短、可重復性高等優勢，從工作站中可以對所生成的FF 圖上直接計算出各組織器官感興趣區內的脂肪含量百分比。Ergen 等[18]首次采用IDEAL-IQ 技術展示了定量測量女性椎體脂肪含量的可行性；Hu 等[19]前期實驗首次利用IDEAL-IQ 技術，揭示四氧嘧啶誘導糖尿病兔椎體終板下骨髓腔脂肪含量隨著時間累積的變化，證實了IDEAL-IQ 在實驗動物糖尿病模型上定量評估椎體骨髓脂肪含量是可行的。

目前很多研究都已經發現人體血清中的維生素D 循環水平濃度(以人體血清中的維生素D3 水平為主要指標)可能會與2 型糖尿病患者風險增加相關[20]，同樣糖尿病疾病也會導致鈣、磷及維生素D 水平的減低。維生素D 通過刺激脂肪細胞對葡萄糖的攝取可改善鈣磷平衡及骨代謝[5]。Shab-Bidar等[8]研究表明血清維生素D 水平可與內臟脂肪含量呈負相關，但對于已經生成的脂肪組織尚無明顯改善作用。長期給肥胖小鼠補充維生素D，可誘導炎癥趨化因子mRNA 表達水平降低，有助于肥胖小鼠體內減輕脂肪組織炎癥及改善肝臟脂肪變性趨勢[21]；對于糖尿病患者的皮下脂肪的累積，補充維生素D可以有效限制皮下脂肪的再增加[8]。本實驗利用IDEAL-IQ技術快速、動態監測等特點，定量測定維生素D干預前后糖尿病兔腰椎骨髓脂肪含量值變化，為揭示維生素D影響早期糖尿病骨病中骨髓微環境中脂肪代謝的病理生理機制及未來為臨床評估相關抑脂藥物療效結果提供了較為可靠的影像學證據。

本實驗結果顯示，維生素D干預四氧嘧啶誘導兔糖尿病模型16 周后，兔腰椎骨髓脂肪含量分數值較單純糖尿病組骨髓脂肪分數呈下降趨勢，但兩組間腰椎脂肪FF 值無明顯改變，兩者差異不具有統計學意義。維生素D 作用具有兩重性，合理劑量的1，25-二羥維生素D3 [1，25-(OH)2D3]濃度利于髓內干細胞向成骨細胞分化、成熟，抑制脂肪細胞的累積，改善骨髓微環境平衡[22]；超過生理劑量的1，25-二羥維生素D3 濃度會改變骨髓微環境穩定，抑制成骨細胞分化，提高破骨細胞的活性，從而改變骨髓內脂肪含量。本實驗維生素D 按照實驗動物和人類之間的劑量轉換的簡單實踐指南[23]，轉化為兔模型生理劑量范圍，推測在糖尿病16 周病程中，給藥4 周時間中腰椎骨髓脂肪成分發生的改變，可能因為干預時間過短，或者是給藥濃度較低，使得體內維生素D濃度未達到閾值或藥物持續時間較短未能達到讓IDEAL-IQ技術測得的宏觀脂肪組織改變的表現，這可能是導致維生素D 干預糖尿病骨髓脂肪含量下降趨勢不明顯的重要原因之一。未來的研究應更多地從維生素D 干預時間及干預劑量上評價IDEAL-IQ測量兔糖尿病模型中骨髓脂肪含量分數值的變化。

本實驗的局限性：(1)本實驗研究的樣本量較少，維生素D 對于糖尿病骨髓脂肪含量改變的變化機制仍需要大樣本予以證實；(2)干預組給予維生素D 的劑量及給藥時間較短，對于長期、大劑量維生素D 干預糖尿病骨髓脂肪改變是否存在相同效果仍需要后續研究進一步觀察；(3)糖尿病動物模型的發生發展和臨床患者糖尿病慢性自然病程存在差異。

綜上所述，IDEAL-IQ技術評價維生素D干預四氧嘧啶誘導兔糖尿病模型骨髓脂肪含量變化是可行的，維生素D 干預16 周內，骨髓脂肪含量改變呈現下降趨勢。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。