趕黃草調控Wnt4抑制TGF-β誘導肺纖維化相關基因表達的研究*

熊安英，牛 斌，張 雷，熊 瑛，宋 琦，何 翔，李國平△

(1.國家呼吸系統疾病臨床研究中心成都市第三人民醫院分中心/成都市呼吸健康研究所過敏與精準醫學實驗室，成都610031；2.四川省友誼醫院呼吸與危重癥醫學科，成都 610011；3.西南醫科大學附屬醫院胸外科，四川瀘州 646000)

特發性肺纖維化是最常見的間質性肺病，具有侵襲性和致死性，5年生存率僅為20%[1-2]。該病好發于中老年男性，主要表現為干咳、進行性加重的呼吸困難，伴限制性通氣功能障礙和氣體交換障礙，導致低氧血癥，患者最終因呼吸衰竭而死亡[3-4]。上皮細胞和內皮細胞通過分泌細胞因子和生長因子，如轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、血小板源性生長因子等，誘發肺纖維化的發生[5]。研究表明，TGF-β和Wnt信號通路在肺、肝、消化道等不同器官和系統的組織修復和重塑中發揮了重要作用[6]。多項研究也表明纖維化性肺疾病中TGF-β水平持續升高，可導致過度修復過程和器官功能障礙[7-8]，這為治療特發性肺纖維化增加了困難。目前，延緩特發性肺纖維化進程的藥物主要以吡非尼酮和尼達尼布為主，不良反應大且價格相當昂貴，給患者造成了一定的經濟負擔。因此，尋找一種安全有效且價格低廉的藥物在肺纖維化的防治過程中極為重要。

趕黃草又名扯根菜，是我國分布廣泛的一種天然草本植物。研究發現，趕黃草提取物對乙型肝炎、丙型肝炎、肝癌具有保護作用[9]，同時對乙醇或氧化性導致的肝損傷具有保護作用[10]。ZHOU等[11]發現趕黃草提取物生松素能通過SIRT3-TGF-β-smad信號通路抑制肝星狀細胞的激活進而抑制肝纖維化。目前尚未發現趕黃草治療肺纖維化的相關研究，在本課題組實驗中，通過生物信息學分析發現TGF-β和Wnt4存在相互關系，因此，推測趕黃草可能通過抑制TGF-β和Wnt4相關信號抑制肺纖維化。本研究探討趕黃草對肺纖維化的作用及其機制，以期對趕黃草的研究和臨床應用提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

MRC-5人胚肺成纖維細胞(上海中喬新舟生物科技有限公司)；趕黃草對照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，DZYC-G-028)；RNA simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒、RNA SuperMix試劑盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(中國Vazyme公司)；最低基本培養基(minimum Eagle′s medium,MEM)、胎牛血清、Sodium pyruvate(美國Gibco公司)；MEM Nonessential Amino Acid Solution、丙酮酸鈉、CCK8(中國Solarbio公司)；TGF-β、Wnt4(美國Abcam公司)；纖連蛋白(fibronectin,FN1)、Ⅰ型膠原(中國Bioss公司)；CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(新加坡ESCO公司)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；激光共掃描顯微鏡(德國Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1數據收集

從基因表達數據庫GEO(Gene Exppression Omnibus)中搜索TGF-β組(6個生物重復組)和對照組(5個生物重復組)相關轉錄組學的差異基因RNAs。

1.2.2數據預處理和RNAs的重注釋

利用R軟件的affy包進行數據預處理，對RNAs進行重注釋。使用Agilent GeneSpring GXv12.1軟件進行芯片數據均一化處理和差異分析，經過折疊倍率(fold change，FC)篩選出所有差異表達的RNAs，|lofFC|≥0.3，P<0.05。

1.2.3Wnt信號通路的功能富集和通路分析

使用富集分析工具對Wnt信號通路進行基因本體論(gene ontology，GO)分析，描述該信號通路中基因的表達趨勢；同時將Wnt信號途徑的調節進行GO和REACTOME富集分析比較，進一步闡述TGF-β因子與Wnt信號通路的相互關系。

1.2.4實時熒光定量PCR和激光共聚焦驗證

(1)為了驗證TGF-β和Wnt4之間的相互關系，設立空白組、TGF-β組(5 ng/mL)及Wnt4組(250 ng/mL)，作用24 h后收集細胞提取總RNA，逆轉錄后對FN1、平滑肌肌動蛋白A2(smooth muscle actin A2，ACTA2)、Wnt4進行實時熒光定量PCR實驗。(2)為了探討趕黃草是否通過Wnt4影響TGF-β介導的肺纖維化，對MRC-5細胞進行了趕黃草的毒性實驗。將實驗細胞分為空白組、TGF-β組、趕黃草+TGF-β組，在MRC-5細胞中加入TGF-β處理6 h后加入趕黃草(50 μg/mL)，培養24 h后，激光共聚焦檢測FN1和Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(COL1A1)蛋白熒光定量情況，同時收集細胞和提取總RNA，逆轉錄后進行實時熒光定量PCR實驗。目的基因包括FN1、ACTA2、Wnt4蛋白的表達，見表1。

表1 基因實時熒光定量PCR引物序列

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 TGF-β組和對照組中差異表達基因

GEO數據庫中共獲得差異表達基因12 548個，在這些差異基因中有2 151個基因在TGF-β組低表達，有1 505個基因在TGF-β組高表達，其中Wnt4、ACTA2、COL1A1就屬于高表達基因，見圖1。利用聚類分析找出具有相同生物學過程或相似功能且差異比較明顯的基因100個，選取在TGF-β組表達升高和降低的基因各50個，結果表明TGF-β組與對照組MRC-5細胞標本的生物學過程與功能區分比較明顯；TGF-β組Wnt信號途徑中Wnt4、ACTA2、COL1A1、FN1表達水平升高，其中Wnt4、ACTA2、COL1A1表達水平升高差異有統計學意義(P<0.05)，而FN1表達水平升高不明顯，見圖2。

紅點：表達水平升高基因；藍點：表達水平降低基因；黃點：表達無明顯差異基因；|lofFC|≥0.5，P<0.05。

A：TGF-β組和對照組中100個差異明顯基因熱圖(FC>2.0,P<0.05)；B：Wnt信號途徑中相關基因熱圖。

2.2 Wnt信號通路中基因富集分析

通過GO富集圖形分析，發現Wnt信號通路途徑的調節基因與典型的Wnt信號通路中基因是一致的，且圖形中ES值前的領頭亞集形狀中功能基因集在TGF-β組具有更明顯的生物學意義。TGF-β組對不同數據庫的Wnt信號通路的富集分析發現，TGF-β與Wnt信號通路的激活呈正相關，見圖3。

A：典型Wnt信號通路差異基因的GO富集分析；B：調節Wnt信號途徑的差異基因的GO富集分析；C：Wnt調節的信號通路差異基因的Reactome富集分析；D：Wnt信號通路中差異基因的KEGG分析。

2.3 TGF-β和Wnt4相互關系影響

為驗證以上生物信息學分析的可靠性，在MRC-5細胞中加入TGF-β，發現FN1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，同時Wnt信號通路中Wnt4基因mRNA表達水平也升高(P<0.05)；為了進一步說明TGF-β誘導肺纖維化是通過調控Wnt4，在MRC-5細胞中加入Wnt信號通路中的Wnt4進行處理，發現纖維化相關蛋白FN1 mRNA表達水平升高(P<0.05)，見圖4。

A：TGF-β處理后FN1 mRNA表達水平；B：TGF-β處理后Wnt4 mRNA表達水平；C：Wnt4處理后FN1 mRNA表達水平。

2.4 趕黃草調控Wnt4抑制TGF-β誘導的肺纖維化

為驗證趕黃草對MRC-5細胞的毒性，加入了不同濃度的趕黃草進行CCK8毒性實驗，結果發現當趕黃草的濃度達到50 μg/mL時，MRC-5細胞培養24 h后沒有明顯的細胞毒性。在MRC-5細胞中加入TGF-β處理后與空白組比較，其FN1、ACTA2、Wnt4 mRNA水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；在TGF-β組加入趕黃草后，其FN1、ACTA2、Wnt4 mRNA水平較TGF-β組明顯降低(P<0.05)；同時通過激光共聚焦檢測各組MRC-5細胞中不同處理后的COL1A1和FN1蛋白熒光定量，其結果與實時熒光定量PCR結果一致，空白組COL1A1和FN1表達水平與TGF-β組比較明顯降低，趕黃草+TGF-β組與TGF-β組比較，其纖維化蛋白COL1A1和FN1的水平也明顯降低(P<0.05)，見圖5。

A：不同濃度的趕黃草對MRC-5細胞的活力影響；B：實時熒光定量PCR檢測趕黃草對MRC-5細胞中TGF-β誘導的Wnt信號通路的影響；C：共聚焦顯微鏡觀察趕黃草處理MRC-5細胞后Wnt信號通路中COL1A1和FN1的熒光強度；D：定量分析COL1A1和FN1熒光強度；a:P<0.05，與0 μg/mL趕黃草比較。

3 討 論

特發性肺纖維化是一種由異常的創傷愈合進程導致的疾病，其中上皮細胞損傷啟動炎性因子，導致炎性細胞浸潤、成纖維細胞異常增殖和膠原蛋白沉積[12-14]。TGF-β是一種對細胞分化增殖和炎性反應具有綜合調節作用的多功能細胞因子[7]，在組織纖維化信號的啟動中發揮著重要作用[15]。此外，TGF-β誘導上皮-間質轉化和內皮-間質轉化，同時肺內的肺泡上皮或內皮細胞向遷移性成纖維細胞轉化[16]。Wnt信號通路是一組由蛋白質組成的信號轉導通路，通過細胞表面受體將信號從細胞外傳遞到細胞內[17]。最近的研究表明，Wnt信號通路的成分已成為靶器官抑制纖維化的潛在靶點[18]。Wnt4是Wnt蛋白家族中的一員，作為局部作用的信號分子，調節細胞間的相互作用、增殖和遷移[19]。對成人子宮Wnt4的表達進行分析，發現Wnt4可參與調節子宮內膜基質細胞的增殖、存活和分化[20]。Wnt4/β-catenin信號通路已經證實可參與肝纖維化[21]、肺纖維化[22]的發生、發展。LAM等[23]報道Lrp5缺失小鼠由于廢除了Wnt/β-catenin信號通路，對博萊霉素誘導的肺纖維化具有保護作用。本研究對GEO數據庫的微陣列數據集進行GO和Wnt信號通路富集分析，發現TGF-β是調節Wnt信號途徑的一個重要因素，隨著TGF-β的加入Wnt信號途徑即被激活，這與SPANJER等[24]發現Wnt受體能介導TGF-β誘導的促纖維化信號通路是一致的。但Wnt信號通路中配體、受體和共受體怎樣參與TGF-β誘導的肺纖維化的調控尚不清楚。因此，了解Wnt調節的纖維化的潛在機制對于器官纖維化、鈣化和異常血管重構等的有效治療是必不可少的。

近年來隨著臨床輔助檢查水平的不斷提高，越來越多的特發性肺纖維化患者在早期病程中被及時發現，但目前該病尚無較好的治療手段，且治療的同時不良反應較大。中藥在治療特發性肺纖維化上具有獨特的優勢，目前多項研究已經證實中藥能改善特發性肺纖維化患者癥狀、肺功能，提高患者生活質量，增加患者動脈血氧分壓[25]。其中趕黃草作為一種天然草本植物，價格較低廉，研究發現趕黃草的提取物對乙醇或氧化性肝損傷具有保護作用[10]。從該植物中已鑒定出30多個具有抗氧化、抗癌和降血糖作用的化合物[9]。趕黃草中的生松素是中草藥中常見的一種類黃酮，在不同細胞系中已被報道具有抗肝硬化和抗纖維化成分[26]，且對肝纖維化有治療作用[11]。在用過氧化叔丁基誘導L02細胞氧化損傷模型中，趕黃草中的水提物顯示出了對肝臟的保護作用[27]。為了進一步研究趕黃草對肺纖維化的潛在機制，本研究在MRC-5細胞中加入TGF-β后，FN1、ACTA2表達基因上調明顯，說明TGF-β誘導的肺纖維化細胞模型成功，同時Wnt信號通路中的Wnt4基因表達也明顯升高，說明TGF-β能誘導Wnt4的表達。同時在MRC-5細胞中加入Wnt4后，纖維化相關的FN1表達水平也升高，說明Wnt4能調控纖維化，這與Wnt4/β-catenin信號通路可介導肺纖維化的發生、發展是一致的[22]。當加入趕黃草后發現Wnt4表達明顯降低，同時纖維化相關基因FN1、ACTA2、COL1A1的表達水平也明顯下降，說明趕黃草對TGF-β誘導的肺纖維化具有保護作用，且可能是通過調控Wnt4實現的，這與LAM等[28]發現抑制Wnt信號通路可以有效抑制小鼠肺纖維化的發生、發展一致。在高侵襲性鱗狀細胞癌細胞研究中，Wnt4還參與癌細胞晚期發生過程中細胞黏附，細胞運動和與上皮細胞向間充質細胞轉變相關的侵襲[29]。SPANJER等[24]發現沉默FZD8能使TGF-β誘導的纖維化的Ⅰ型膠原、FN1、多能蛋白聚糖、ACTA2和結締組織生長因子表達水平降低，同時沉默FZD7可抑制TGF-β1誘導的肺纖維化，且能夠通過典型或非典型的Wnt信號通路進行信號轉導參與組織纖維化的調節[30]。結合上述研究結果，趕黃草可能通過抑制Wnt信號通路中的Wnt4基因來達到抗纖維化的目的。

綜上所述，趕黃草能降低TGF-β誘導的肺纖維化，可能是通過調控Wnt信號通路中的Wnt4實現的。由于趕黃草包含的藥理和化學成分比較復雜，不能明確趕黃草的哪種成分發揮抗肺纖維化作用，因此，后續將繼續對趕黃草的藥理進行研究，以期待找出趕黃草抗纖維化的有效成分，為治療肺纖維化提供新的候選藥。