熱療及熱休克蛋白對(duì)腫瘤免疫應(yīng)答的影響△

智曉玉，李衛(wèi)威，王少偉，燕翔，汪進(jìn)良#

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心1腫瘤內(nèi)科，2研究生院，北京 100853

3解放軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 張家口 075000

4天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤生物學(xué)研究室，天津 300060

發(fā)熱被認(rèn)為是機(jī)體主要的防御機(jī)制之一，一些早期的抗腫瘤免疫治療的經(jīng)驗(yàn)表明，可通過發(fā)熱來進(jìn)行抗腫瘤治療。19世紀(jì)60年代，William Coley發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌毒素治療有助于抑制肉瘤、淋巴瘤等腫瘤的進(jìn)展，且其中高熱患者的生存時(shí)間更長，證實(shí)了以免疫治療為基礎(chǔ)的抗腫瘤治療的有效性，也促使加熱治療（簡(jiǎn)稱熱療）成為抗腫瘤治療的新手段。目前，以高熱作為腫瘤治療方法，并不是利用發(fā)熱作為提高體溫的來源，而是采用體外加熱來升高溫度。局部及局域熱療是最初的熱療手段，目前，全身熱療也被不斷地探索且成果顯著，于是，學(xué)者們對(duì)熱療能夠有效抑制腫瘤生長的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探究。本文在既往研究成果的基礎(chǔ)上，將熱療及熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）對(duì)腫瘤患者先天性及獲得性免疫應(yīng)答的影響進(jìn)行綜述。

1 HSP的生成

1962年，Ritossa將果蠅幼蟲的飼養(yǎng)溫度從25℃提高至30℃，30 min后觀察到了果蠅多絲染色體上的蓬松現(xiàn)象，提示這些區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄加強(qiáng)并可能導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)的合成增加。1974年，Tissières等研究結(jié)果證實(shí)，上述現(xiàn)象確實(shí)是由果蠅體溫升高增強(qiáng)了這一區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致，并生成了一系列分子量為70 kD和26 kD的蛋白質(zhì)，遂被命名為HSP。HSP可存在于多種亞細(xì)胞復(fù)合體中，如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核仁、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體，是一類高度保守的蛋白質(zhì)。生理?xiàng)l件下，大多數(shù)HSP作為蛋白伴侶持續(xù)表達(dá)，可調(diào)節(jié)蛋白折疊，促進(jìn)蛋白復(fù)合物構(gòu)成，調(diào)控蛋白降解；應(yīng)激狀態(tài)下，如高熱、乏氧、葡萄糖剝奪、酸中毒、感染，HSP的表達(dá)均可迅速上調(diào)。人類基因命名委員會(huì)（Human Gene Nomenclature Committee，HGNC）依據(jù)HSP分子量將其分為HSPH（HSP110）、HSPC（HSP90）、HSPA（HSP70）、DNAJ（HSP40）、小分子HSP（small heat shock protein，sHSP）和 CCT（TRiC）。目前，已發(fā)現(xiàn)HSP在多種腫瘤組織中的表達(dá)水平高于正常組織。

2 熱療及HSP對(duì)腫瘤先天性免疫應(yīng)答的影響

先天性免疫應(yīng)答是人體抵御病原體的第一道防線。先天性免疫應(yīng)答細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、巨噬細(xì)胞和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞，其中NK細(xì)胞是主要的殺傷細(xì)胞。NK細(xì)胞通過表達(dá)多種激活和抑制受體來調(diào)控其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類抗原（major histocompatibility complex antigenⅠ，MHCⅠ）作為效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞識(shí)別靶點(diǎn)的同時(shí)，也是NK細(xì)胞的抑制配體，部分腫瘤細(xì)胞為躲避T淋巴細(xì)胞的殺傷作用而上調(diào)MHCⅠ的表達(dá)，但卻激活了NK細(xì)胞對(duì)它們的識(shí)別與殺傷作用。Ostberg等的研究發(fā)現(xiàn)，熱療主要是通過上調(diào)NK細(xì)胞表面激活受體2D（natural killer cell receptor group 2D，NKG2D）及其配體MHCⅠ類鏈相關(guān)蛋白A（major histocompatibility complex classⅠ-related chain A，MICA）的表達(dá)來促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)人直腸癌細(xì)胞Colo205的殺傷作用。Gastpar等的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞外泌體中的HSP70可以進(jìn)一步提高NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及殺傷能力，且有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，熱療還有助于NK細(xì)胞向腫瘤組織轉(zhuǎn)移。

3 熱療及HSP對(duì)腫瘤獲得性免疫應(yīng)答的影響

獲得性免疫應(yīng)答主要由7個(gè)關(guān)鍵步驟組成（圖1）：①腫瘤抗原的釋放；②抗原呈遞細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的攝取及呈遞；③T細(xì)胞的激活及增殖；④T細(xì)胞向腫瘤組織轉(zhuǎn)移；⑤T細(xì)胞浸潤至腫瘤組織；⑥T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別；⑦腫瘤細(xì)胞最終被殺傷。熱療及HSP可以增強(qiáng)此過程中的多個(gè)步驟的作用。

圖1 腫瘤免疫應(yīng)答流程圖

3.1 抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的攝取及呈遞

在獲得性抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中，DC是最主要的抗原呈遞細(xì)胞（antigen presentation cell，APC）。腫瘤抗原被DC吞噬后將以HSP復(fù)合物的形式通過內(nèi)源性抗原呈遞途徑交叉呈遞給MHCⅠ類分子。熱療不僅可提高HSP的含量，還可以通過誘導(dǎo)免疫蛋白酶體的特殊亞單位LMP2和LMP7的表達(dá)來增強(qiáng)腫瘤抗原向DC呈遞。接受抗原呈遞后，DC將逐漸成熟并進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至二級(jí)淋巴器官激活幼稚T淋巴細(xì)胞。Ostberg等的研究發(fā)現(xiàn)，熱療可促使小鼠體溫升高至39.5～40.0℃，有助于誘導(dǎo)DC成熟并向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，HSP60、HSP70、HSP90、gp96均可以促進(jìn)DC成熟，且HSP還可以通過誘導(dǎo)成熟DC分泌細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α，來進(jìn)一步促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答。

3.2 T細(xì)胞的激活與增殖

幼稚T淋巴細(xì)胞將于二級(jí)淋巴器官，如淋巴結(jié)、派爾集合淋巴結(jié)（Peyer’s patch，PP），與成熟DC表面主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）/腫瘤抗原復(fù)合物結(jié)合，從而獲得免疫應(yīng)答能力。熱療及HSP對(duì)幼稚T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移至二級(jí)淋巴器官（歸巢）及T淋巴細(xì)胞在二級(jí)淋巴器官的激活與增殖均有影響。

成熟DC及大多數(shù)幼稚T淋巴細(xì)胞可表達(dá)CCR7，其可以順應(yīng)二級(jí)淋巴器官分泌的細(xì)胞因子CC趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）19、CCL21的濃度梯度完成歸巢。在歸巢過程中，免疫細(xì)胞需要通過L-選擇素、α4β7整合素與細(xì)胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）進(jìn)行結(jié)合穿過高內(nèi)皮小靜脈（high endothelial venule，HEV）后，才可最終到達(dá)淋巴結(jié)或PP。Evans等對(duì)小鼠進(jìn)行6 h全身熱療（39.8±0.2）℃后發(fā)現(xiàn)，小鼠外周循環(huán)淋巴細(xì)胞數(shù)目減少的同時(shí)，PP及外周淋巴結(jié)（peripheral lymph node，PLN）中淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯升高數(shù)倍，表明熱療可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞歸巢。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，熱療是通過提高HEV的ICAM-1、CCL2的表達(dá)，上調(diào)淋巴細(xì)胞的L-選擇素及整合素的表達(dá)，來促進(jìn)淋巴細(xì)胞與HEV的相互作用。Lin等的研究發(fā)現(xiàn)，熱療是通過促進(jìn)HSP90與α4整合蛋白相互作用來增強(qiáng)T細(xì)胞的黏附與轉(zhuǎn)移。

已有研究證實(shí)，熱療可以增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答能力。Mace等將 CD62LCD44表達(dá)的前黑素小體蛋白-1（premelanosome protein-1，Pmel-1）CD8T淋巴細(xì)胞與表達(dá)gp100肽的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行抗原依賴性激活共培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度達(dá)到39.5℃時(shí)，分化為CD62LCD44的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量明顯高于培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)；對(duì)該研究結(jié)果的原理進(jìn)行了深入探究發(fā)現(xiàn)，熱療通過增強(qiáng)CD8T淋巴細(xì)胞的膜流動(dòng)性，導(dǎo)致GM1CD微區(qū)、TCRβ及CD8共受體聚集，從而促使DC與T淋巴細(xì)胞結(jié)合更加緊密。另有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，熱療是通過激活T淋巴細(xì)胞蛋白激酶（protein kinase，PK）C、PKCβ、PKCθ，以及蛋白激酶C1受體來促進(jìn)T細(xì)胞的激活。Di等的研究發(fā)現(xiàn)，HSP70因與PKC共定位，在T淋巴細(xì)胞激活過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，熱療及HSP60也可以通過促進(jìn)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞IFN-γ的分泌來進(jìn)一步影響免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3.3 T細(xì)胞向腫瘤組織轉(zhuǎn)移及浸潤

幼稚T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞后，其表面的CCR7表達(dá)下調(diào)，有助于效應(yīng)T細(xì)胞離開淋巴組織向腫瘤組織轉(zhuǎn)移。Fisher等利用體內(nèi)熒光顯微術(shù)發(fā)現(xiàn)，一般情況下，小鼠腫瘤模型中CD8T淋巴細(xì)胞與腫瘤血管的相互作用較低，但給予熱療后CD8T淋巴細(xì)胞與腫瘤血管的相互作用可以提升至5倍以上。

3.4 T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷

腫瘤組織中，效應(yīng)T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）識(shí)別表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的MHC/抗原復(fù)合物，并通過誘導(dǎo)細(xì)胞裂解或凋亡來對(duì)其進(jìn)行殺傷。細(xì)胞裂解性殺傷指效應(yīng)T細(xì)胞通過誘導(dǎo)分泌穿孔素和顆粒酶來殺傷腫瘤細(xì)胞；誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，即效應(yīng)T細(xì)胞表達(dá)的Fas配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合促使下游通路激活導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究顯示，熱療可以通過誘導(dǎo)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞FasL的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

在機(jī)體免疫系統(tǒng)抗腫瘤的過程中，腫瘤組織可以通過調(diào)節(jié)自身免疫微環(huán)境來逃避殺傷作用。調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞可表達(dá)CD4、CD25和叉頭框蛋白 P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3），均是T淋巴細(xì)胞亞群。通過抑制免疫細(xì)胞（DC、NK、T細(xì)胞）增殖可以負(fù)向調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫應(yīng)答。Treg通常占CD4T細(xì)胞的5%～10%，但在腫瘤微環(huán)境中卻可以高達(dá)20%～30%，導(dǎo)致多種腫瘤（卵巢癌、胸部腫瘤、腎癌、胰腺癌）患者的預(yù)后不良。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，熱療可以降低腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞水平。程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）作為分子“防御”機(jī)制，可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受效應(yīng)T細(xì)胞的殺傷作用。Kokura等的研究發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)溫度升高至40～43℃時(shí)，腫瘤細(xì)胞系PD-L1的表達(dá)下調(diào)，表明熱療有利于改善腫瘤免疫微環(huán)境從而促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。

4 小結(jié)與展望

熱療及HSP可以對(duì)機(jī)體抵抗腫瘤免疫應(yīng)答的多個(gè)方面發(fā)揮促進(jìn)作用，但仍有許多潛在的問題需要進(jìn)一步探究。首先，熱療方式（全身熱療、局部熱療、局域熱療）及熱療設(shè)備（微波熱療、超聲波熱療、射頻熱療、紅外線熱療）多種多樣，哪種選擇可以給患者帶來更多的獲益尚需進(jìn)一步探討；其次，目前熱療溫度為38.5～42.0℃，選擇范圍較寬，熱療溫度選擇的進(jìn)一步精細(xì)化非常必要；有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HSP70可以有效抑制腫瘤（胰腺癌、前列腺癌、胃癌）細(xì)胞凋亡，且腫瘤組織中HSP（HSP27、HSP70、HSP90）表達(dá)上調(diào)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。因此，仍需進(jìn)一步探討在機(jī)體復(fù)雜環(huán)境下熱療及HSP對(duì)抗腫瘤治療的影響，旨在能夠使單純熱療或熱療聯(lián)合治療（如聯(lián)合放療、化療、靶向治療、免疫治療等）給腫瘤患者帶來更多的獲益。