大黃素誘導人肝癌索拉菲尼耐藥細胞凋亡的作用機制

俞清江 張浩 王清清

肝癌是導致惡性腫瘤相關死亡的第三大病因［1］。多數患者發現時往往已是中晚期，或失去手術機會，即使行根治性手術，5年內復發轉移率高達60%～70%，預后極差［2-4］。索拉菲尼（Sorafenib）是晚期肝癌的一線推薦用藥［5］，但長期使用可引起患者耐藥，其療效有所限制。研究表明，大黃素（Emodin）可作為輔助用藥增強化療藥物的敏感性［6］，其廣泛存在于大黃、虎杖、何首烏等中藥材中，是一種天然蒽醌衍生物，目前已被用于胰腺癌、胃癌、直腸癌等多種惡性腫瘤的臨床治療［7-8］。本研究初步探討大黃素增強肝癌索拉菲尼耐藥細胞對索拉菲尼的藥物敏感性的作用機制，為臨床上治療晚期肝癌索拉菲尼耐藥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人肝癌Huh7細胞株，購自中國科學院上海生命科學院細胞所；胎牛血清（FBS），購自美國Gibco公司；DMEM/F12培養基，購自美國Hyclone公司；大黃素（Emodin）購自成都普瑞法科技開發有限公司；一抗兔抗人Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、Caspase3、GAPDH均購自美國Abcam公司；RIPA裂解液、胰酶細胞消化液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin-FITC凋亡試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 研究方法 （1）細胞培養：本課題組前期已用濃度遞增誘導法成功誘導人肝癌Huh7SR細胞［9］，使用含10% FBS的DMEM/F12培養基，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養Huh7SR細胞，取生長狀態良好、對數生長期的Huh7SR細胞經胰酶消化后，制成濃度5×104/L的細胞懸液，之后接種于96孔板上，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后，丟棄培養液，加入不同濃度（10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM）大黃素的培養基作為實驗組，不含Emo的培養基作為對照組，只含培養基無細胞為空白組，各組干預48 h。（2）CCK8檢測大黃素對人肝癌索拉菲尼耐藥細胞活性的影響：實驗組、對照組和空白組培養基上每孔加入CCK8溶液10 μL，在37 ℃下繼續培養1.5 h，采用酶標儀（波長450 nm）檢測各孔的吸光度（A）值，計算細胞存活率，細胞存活率=（實驗組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。（3）分組：根據處理因素的不同進行分組，對照（Con）組人肝癌Huh7SR細胞不作處理，索拉菲尼（Sora）組加入2 μM索拉菲尼，大黃素（Emo）組加入25 μM大黃素、聯合（Com）組加入2 μM索拉菲尼和25 μM大黃素，經干預處理48 h后，用預冷的PBS清洗三次。（4）流式細胞術檢測大黃素對Huh7SR凋亡的影響：將經胰酶消化、離心后收集的Huh7SR細胞重懸于500 μL結合緩沖液中，之后加入5 μL Annexin V-FITC溶液輕輕混勻，再加入10 μL 碘化丙啶（PI）染色混勻，室溫避光下繼續染色30 min，1 h內完成檢測，重復3次取平均值。（5）蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測相關蛋白：Con組、Sora組、Emo組和Com組均加入細胞蛋白裂解液（RIPA裂解液：PMSF=100∶1），置于冰山裂解30 min，提取各組細胞總蛋白，在4 ℃環境中、以12,000 r/min離心15 min，留取上清液；使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；沸水煮沸10 min使蛋白變性后儲存備用；各組取約30 μg蛋白置于10%SDSPAGE電泳分離，濕轉法轉至NC膜上，加入5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h；各組分別加入相應的一抗4 ℃孵育過夜，PBST漂洗3次，辣根過氧物酶標記的二抗在室溫下孵育1.5 h，PBST再次漂洗3次后加入ECL化學發光液顯影，化學發光儀器采集圖片，Image J軟件分析灰度值并計算目標蛋白的相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度大黃素對人肝癌Huh7SR細胞增殖活力的影響 CCK-8實驗結果顯示，隨著大黃素濃度的增加，人肝癌Huh7SR細胞的增殖活力逐漸下降，呈現濃度梯度關系。見圖1。

圖1 大黃素干預后人肝癌Huh7SR細胞的生存率變化

2.2 大黃素對肝癌Huh7SR細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，Com組凋亡率高于Con組、Sora組和Emo組，提示大黃素能夠促進Sora對肝癌Huh7SR細胞發生凋亡。見圖2。

圖2 四組肝癌Huh7SR細胞的凋亡率比較

2.3 大黃素對人肝癌Huh7SR細胞凋亡相關蛋白表達的影響 Western blot實驗結果顯示，Com組的促凋亡相關蛋白Bax、Caspase3表達顯著高于Con組、Sora組和Emo組，抑凋亡相關蛋白Bcl-2表達顯著低于Con組、Sora組和Emo組，差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖3、表1。

圖3 四組人肝癌Huh7SR細胞凋亡相關蛋白表達變化

表1 四組人肝癌Huh7SR細胞凋亡相關蛋白相對表達量的比較

2.4 大黃素對人肝癌Huh7SR細胞PI3k/Akt信號通路相關蛋白表達的影響 Western blot實驗結果顯示，Com組的p-Akt蛋白表達顯著低于Con組、Sora組和Emo組，差異有統計學意義（P<0.01）；Akt蛋白表達四組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4、表2。

表2 四組人肝癌Huh7SR細胞PI3k/Akt信號通路蛋白相對表達量的比較

圖4 四組人肝癌Huh7SR細胞PI3k/Akt信號蛋白的表達變化

3 討論

大黃素具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗菌、抗過敏、抗骨質疏松、抗糖尿病、免疫抑制、神經保護和護肝等藥理作用［10］，與多種化療藥物聯合應用能夠誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長［11-12］。目前，關于大黃素聯合小劑量索拉菲尼對肝癌索拉菲尼耐藥細胞的增殖抑制和凋亡誘導的研究甚少，而分子水平的調控機制尚不明確。

PI3k/Akt信號通路是細胞內重要信號轉導通路之一，通過調控細胞的增殖、凋亡、耐藥，參與多種腫瘤的發生發展過程。本課題組前期研究發現，肝癌索拉菲尼耐藥與PI3k/Akt信號通路激活密切相關，LY294002呈時間和濃度依賴性，通過抑制PI3k/Akt信號通路可以抑制人肝癌索拉菲尼耐藥細胞的增殖［9］。由于PI3k/Akt信號通路參與大黃素聯合低濃度索拉菲尼誘導人肝癌Huh7SR細胞凋亡的機制研究甚少，本研究將人肝癌Huh7SR細胞根據處理藥物的不同分為Con組、Emo組、Sora組和Com組，探討四組PI3k/Akt信號通路相關蛋白和凋亡相關蛋白表達差異。Western blot結果顯示，Com組的p-Akt蛋白表達水平顯著下降，促凋亡蛋白Caspase3、Bax顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著下降。石雪萍等［13］研究提出，PI3k/Akt 信號通路通過使Akt激活為p-Akt，調節其下游的凋亡相關蛋白Caspase3、Bax 和Bcl-2等，調控細胞增殖以及凋亡。本課題組研究指出，大黃素聯合低濃度索拉菲尼可能通過抑制PI3k/Akt信號通路進而誘導肝癌索拉菲尼細胞的凋亡。

綜上，大黃素聯合低濃度索拉菲尼抑制肝癌索拉菲尼耐藥細胞的增殖，并誘導其凋亡，其機制可能與PI3k/Akt信號通路抑制有關。因本研究未行相對應的體外實驗，故尚有一定局限性。