消膽胺通過激活肝內FXR信號靶向改善非酒精性脂肪性肝炎的機制分析

孫奕凡 臧淑妃* 楊傳玉 汪麗紅

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是單純性脂肪肝（NAFLD）進展為肝硬化的限速步驟［1-2］。基于我國龐大的NAFLD人群和較高的NASH發(fā)生率，對NASH患者進行及時有效的干預具有重要意義。膽汁酸（BA）是由肝細胞以膽固醇為原料合成并分泌的具有兩性結構的分子［3-4］，膽汁酸代謝異常與NASH的進展關系密切［5］。消膽胺（CHY）作為膽汁酸螯合劑，臨床上用于降低膽固醇，基礎實驗中用于去除實驗動物體內的內源性膽汁酸［4，6］，但其對代謝的影響尚不清楚。而法尼醇X受體（FXR）作為膽汁酸代謝關鍵分子，激活后可改善NASH炎癥和纖維化［7］。本研究擬采用課題組前期建立的ApoE-/-小鼠NASH模型予以CHY干預，觀察其對FXR的影響以及防治NASH的作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 造模及分組 40只SPF級6周齡雄性ApoE-/-小鼠平均分為4組，對照（LFD）組給予低脂飲食（LFD，貨號98121701，品牌Research Diet，美國）喂養(yǎng)，NASH模型（HFHC）組給予高脂高膽固醇飲食（HFHC，貨號D12079B，品牌Research Diet，美國）喂養(yǎng)，CHY對照（LFD+CHY）組給予低脂飲食+2%CHY（貨號C4650，美國Sigma）喂養(yǎng)，CHY干預（HFHC+CHY）組給予高脂高膽固醇飲食+2%CHY喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)12周。

1.2 實驗方法 （1）血液學指標檢測：小鼠喂養(yǎng)12周后，采用戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血800～900 μL后，頸椎脫位法處死，立即無菌獲取肝臟、腸道，液氮速凍并置于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｑ褐糜?.5 mL離心管靜置2 h后，以3000 r/min離心15 min，取上清，使用日立7180全自動生化分析儀測定谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）等指標水平。（2）熒光定量RT-PCR：取腸道及肝臟組織約50 mg，采用TRIZOL/氯仿抽提法提取總RNA，抽提的RNA純度、濃度均到達質控要求（濃度至少200 ng/μL，純度1.9～2.0）后，使用羅氏逆轉錄試劑盒（批號：32460620，品牌：Roche，德國）cDNA第一鏈合成系統逆轉錄合成cDNA，以20 μL反應體系使用SYBR Green mix（批號：04913914001，品牌：Roche，德國）熒光定量，進行PCR擴增，通過2-ΔΔCT計算mRNA表達的相對水平。（3）油紅O染色：新鮮肝臟冰凍切片，厚度10 μm，10%多聚甲醛固定40 min，PBS清洗3次，每次10 min，再經60%異丙醇漂洗30 s；采用新鮮現配6∶4油紅O染色液染色15～20 min，60%異丙醇清洗3次，每次10 s，蒸餾水清洗10 s，蘇木素復染核5 min，流水沖洗10 s，甘油明膠封片，光鏡下觀察拍照。（4）Western Blot：采用RIPA裂解法提取總蛋白，使用酶標儀采用BCA法測定所提蛋白的濃度，之后根據蛋白濃度及上樣量，添加5X蛋白上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min使蛋白變性，根據所測蛋白分子量配膠，40 ng蛋白量上樣，上層膠80 V 30 min+下層膠120 V 2 h電泳，10%牛奶封閉1 h后一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min，應用化學發(fā)光成像系統進行圖像采集、分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間均數比較采用ANOVA單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊者采用LSD或SNK法，方差不齊者采用Tamhane或Dunnett法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的體質量、肝重及各項血清學生化指標比較 見圖1。HFHC和LFD連續(xù)喂養(yǎng)12周后，HFHC組體重、肝體重比以及血清ALT、AST、TG、TC水平均明顯高于LFD組（P<0.05）；與HFHC組相比，CHY+HFHC組小鼠的體重、肝體重比以及血清ALT、AST、TG、TC水平均顯著降低（P<0.05）。

圖1 A. 四組小鼠體質量比較；B. 四組小鼠肝體重比較；C. 四組小鼠的血清ALT水平比較；D. 四組小鼠的血清AST水平比較；E. 四組小鼠的血清TG水平比較；F.四組小鼠的血清TC水平比較；***P<0.001；**P<0.01，*P<0.05

2.2 各組小鼠的肝組織病理學結果 油紅O染色結果顯示，LFD組小鼠無明顯脂肪變，HFHC組小鼠出現明顯脂肪變；予以CHY干預后，LFD+CHY組和HFHC+CHY組的油紅O染色面積、密度、染色程度均較對照組明顯降低，說明CHY干預能夠明顯減輕肝內形成。見圖2。

圖2 各組小鼠的肝組織病理學結果

2.3 各組小鼠肝臟內炎癥因子表達水平比較 與 HFHC組比較，HFHC+CHY組小鼠的肝內KC活化標志分子CD68（P<0.001）、F4/80（P<0.001）和炎癥相關 分 子TNF-α（P<0.01）、MCP-1（P<0.001）、TLR4（P<0.05）的mRNA水平均顯著下降，見圖3 A-B。肝組織勻漿ELISA結果顯示，HFHC+CHY組小鼠肝內TNF-α（P<0.01）、IL-1β（P<0.001）的表達水平均明顯下降，見圖3C。小鼠肝臟組織行IHC CD68與F4/80染色，結果顯示HFHC+CHY干預組的CD68和F4/80陽性灶明顯減少，說明CHY可改善HFHC誘導的KC活化，見圖4-5。

圖3 A-B. 各組小鼠肝內CD68、F4/80、TNF-α、MCP-1及TLR4的mRNA水平比較；C. 各組小鼠肝臟炎癥因子TNF-α、IL-1β 水平比較

圖4 各組小鼠肝臟組織CD68免疫組化結果（DAB×200）

2.4 各組小鼠肝臟內FXR及SHP mRNA信號分子表達水平比較 與LFD對照組比較，NASH模型組小鼠肝內FXR（P<0.001）、SHP（P<0.001）的表達均顯著下調，經CHY干預后，FXR（P<0.01）、SHP（P<0.01）的表達均顯著上調，見圖6。Western blot實驗結果顯示，NASH模型組小鼠的肝內FXR信號受損，FXR、SHP分子蛋白的表達顯著下降，經CHY干預后發(fā)生明顯上調，見圖7。

圖5 各組小鼠肝臟組織F4/80免疫組化結果（DAB×200）

圖6 各組小鼠肝臟FXR及相關分子SHP mRNA 的表達

圖7 各組小鼠肝內FXR及SHP蛋白的表達水平

3 討論

近年來，腸道菌群被認為是NASH“多重打擊”中的一個重要環(huán)節(jié)［8］。飲食、藥物、內源性激素等原因導致的菌群失調破壞腸道屏障功能，產生過度的內毒素和PAMPs［9］通過通透性增加的腸道屏障，經門靜脈循環(huán)到達肝臟，激活肝內炎癥的級聯反應，可造成長期慢性的肝臟炎癥損傷。有證據顯示，NASH動物模型經CHY干預治療可明顯改變腸道微生物的菌群結構，減少腸源性內毒素和毒性代謝產物的產生與吸收，修復腸道屏障功能，恢復腸道的通透性，從而達到改善NAFLD/NASH的作用。膽汁酸作為腸道菌群代謝物的一種，具有體內FXR等受體的天然配體，其介導的生物學信號，尤其是FXR信號，可以通過抑制CYP7A1、CYP8B1兩種膽汁酸合成酶的表達，從而負反饋調控膽汁酸的合成，在NASH的發(fā)展中起重要作用［10］。研究表明，敲除FXR可以破壞機體的糖脂代謝，促進肝臟的脂肪變性及炎癥的進展，應用外源性FXR抑制或激動劑、或是消除內源性膽汁酸均可顯著改善NAFLD的進展［11］。本研究試圖驗證CHY干預與FXR信號表達的關系，并探究其與HFHC誘導的NASH是否相關。

本研究發(fā)現，HFHC誘導12周的ApoE-/-小鼠出現明顯的肝臟脂肪性變與炎癥表現，轉氨酶、血脂等血清學指標和CD68、F4/80、TNF-α等炎癥因子水平表達均明顯升高，且與肝臟組織病理學表現一致。經CHY干預后，HFHC模型小鼠的各項炎癥指標均明顯改善，病理學結果亦證明CHY干預能夠減輕肝臟炎癥。CD68與F4/80是Kupffer細胞的標志物，而Kupffer細胞募集和活化在NAFLD炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用［7，12］，提示CHY對炎癥的改善作用可能與其對Kupffer細胞活化的抑制有關。另外，NASH模型小鼠出現肝內FXR信號相關分子的顯著下調，包括FXR、SHP。經CHY干預后，NASH模型小鼠的FXR信號抑制狀態(tài)得到明顯改善，可能是CHY通過激活膽汁酸代謝過程中的FXR信號，減輕KC細胞的活化，抑制了NASH的發(fā)生發(fā)展。

綜上，本研究證實CHY對NASH具有防治作用，為將CHY作為防治NASH的潛在藥物提供了實驗依據。