膽汁淤積性肝損傷大鼠肝臟組織中水通道蛋白8/9表達(dá)的變化

葉蕾 張婷婷 曹婕露 陳曦 姚侃男 姚嘉明 陳芝蕓 嚴(yán)峻彬

膽汁淤積是一類由于肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞分泌膽汁障礙或膽汁運(yùn)行障礙導(dǎo)致的極具破壞性的肝臟疾病［1-2］，若未及時進(jìn)行治療，膽汁淤積進(jìn)一步惡化會造成肝損傷，最終導(dǎo)致肝硬化或肝功能衰竭［3-4］。水通道蛋白8（AQP8）和水通道蛋白9（AQP9）均屬水通道蛋白家族，廣泛分布于肝細(xì)胞膜和膽管膜，在調(diào)控膽汁分泌中發(fā)揮重要作用［5-6］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（PKB/AKT）分別是AQP8、AQP9的上游信號通路，PI3K和AKT的激活可以上調(diào)AQP8、AQP9的表達(dá)［7-8］。本研究以α-異硫氰酸萘酯（ANIT）誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷大鼠模型，觀察AQP8/9及其上游信號通路PI3K/AKT在大鼠肝臟的動態(tài)變化，為膽汁淤積性肝損傷的防治提供新的治療靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量（140±10）g，SPF級，由上海西普爾-必凱實驗動物中心提供，動物許可證［SCXK（滬）2013-0016］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器 ANIT（Cat：249447）購自北京百靈威科技有限公司；總RNA提取試劑盒（Cat：9767）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Cat：RR036A）、熒光定量PCR試劑盒（Cat：RR820A）均購自寶生物工程（大連）有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（REF：14127070201）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒REF：14126070201）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（REF：141041702201）、總膽紅素（TBIL）試劑盒（REF：14108170201）、總膽汁酸（TBA）試劑盒（REF：13300102101）為德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司產(chǎn)品；總蛋白提取試劑盒（Cat：KGP2100）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒（Cat：PQ0011）、β-actin鼠單抗（Cat：ab008-040）、過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（Cat：GAM007）、過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（Cat：GAR0072）、Potent ECL Kit（Cat：P1425）為杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；AQP8鼠單抗（Cat：sc-81870）、AQP9鼠單抗（Cat：sc-74409）為美國Santa Cruz產(chǎn)品；AKT兔單抗（Cat：4960S）、P-AKT（Ser473）兔單抗（Cat：4060S）、PI3K p85兔單抗（Cat：4257S）為美國Cell Signaling Technology產(chǎn)品。日立7020全自動生化分析儀為日本高新技術(shù)株會會社產(chǎn)品；柏精核酸蛋白分析儀為英國Biochrom公司產(chǎn)品；AB17900熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品；小型垂直電泳電轉(zhuǎn)系統(tǒng)為美國Bio Rad司產(chǎn)品；FCE型ProteinSimple化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)為美國ProteinSimple公司產(chǎn)品。免疫組化所用CK19抗體（Cat：PB9715）為博士德生物公司產(chǎn)品，通用型試劑盒（Cat：PV-6000）和DBA顯色試劑盒（Cat：ZLI-9019）為中杉金橋生物公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組及處理 所有大鼠每籠4只分籠，于明暗處各12 h，溫度 （25±1）℃，相對濕度60%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng)，普通飼料，自由飲水。48只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為模型組和對照組，每組各24只。麻油配制成4%ANIT，模型組大鼠予以ANIT灌胃1次，100 mg/kg，灌胃體積為1 mL/kg；對照組予以等容量麻油灌胃。分別于灌胃后24 h、48 h、72 h三個時間點處理大鼠，每組各8只，處理前16 h禁食不禁水，空腹麻醉下腹腔靜脈取血分離血清待用，分離肝臟，部分組織以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋待用，其余肝組織放入液氮2 h后，凍存于-80 ℃冰箱中待用。

1.4 血清肝功能檢測 采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠的血清ALT、AST、ALP、TBIL 和TBA水平。

1.5 免疫組化檢測膽管上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK19表達(dá) 石蠟組織切片脫蠟至水，H2O2孵育15 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加CK19一抗工作液4 ℃冰箱過夜，PBS代替一抗為陰性對照，加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察CK19陽性顯色表現(xiàn)為胞漿呈黃棕色。

1.6 qRT-PCR檢測肝組織PI3K、AKT1、AKT2、AQP8和AQP9mRNA表達(dá) 以柱式總RNA試劑盒提取肝組織總RNA，核酸蛋白分析儀檢測A260/A280比值在1.8～2.0之間，計算總RNA濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以500 ng總RNA為模板合成cDNA，以下列反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)：2×SYBR5 μL、10μM上下引物各0.4μL、10 ng/ μL的cDNA模板2μL、加dd H2O補(bǔ)充體積至10μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)性5 min，再95℃15 s，60 ℃45 s，循環(huán)擴(kuò)增40次。溶解曲線分析：95 ℃×15 s，60 ℃×5 s，緩慢上升至95 ℃×15 s。以β-actin為內(nèi)參，相對表達(dá)量（2-△△Ct）來表示目的基因PI3K、AKT1、AKT2、AQP8和AQP9的mRNA表達(dá)水平。基因引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計并合成，見表1。

表1 PI3K、AKT1、AKT2、AQP8、AQP9引物

1.7 Western blot檢測肝組織PI3K、AKT1/2、AQP8、AQP9蛋白表達(dá)或磷酸化水平 以全蛋白提取試劑盒經(jīng)precellys-24生物樣品均質(zhì)器裂解成勻漿，離心取上清液采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，加上樣緩沖液95 ℃變性后-80 ℃保存。配置10% SDS-PAGE膠，以每孔50 μg上樣，180 V恒壓電泳40 min，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜60～90 min。使用5%BSA室溫封閉1 h后，加入相應(yīng)一抗工作液PI3K（1∶800）、AKT1/2（1∶700）、P-AKT（1∶600）、AQP8（1∶600）、AQP9（1∶600）、β-Actin（1∶1000），4 ℃冰箱過夜；TBST洗膜后加入相應(yīng)的抗兔或抗鼠二抗（1∶5000），室溫孵育1 h；TBST洗膜后，以ECL在FCE型ProteinSimple化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影，并用AlphaView SA 3.3.0.0軟件分析灰度值，采用目的蛋白灰度值/β-Actin灰度值代表目的蛋白的相對表達(dá)量，P-AKT灰度值/ AKT灰度值代表AKT的磷酸化水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝內(nèi)膽汁淤積大鼠血清肝功能的動態(tài)變化 對照組大鼠的血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平在灌胃后24 h、48 h、72 h三個時相點基本持平。模型組大鼠三個時相點的血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平均較對照組明顯升高（P<0.05）。模型組大鼠灌服ANIT后，血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平均在48 h達(dá)到最高值，72 h有所下降。見圖1。

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05圖1 兩組大鼠在灌胃后24 h、48 h、72 h三個時相點的血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平比較（±s）

2.2 肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝組織CK19表達(dá)的動態(tài)變化 對照組大鼠肝組織中CK19表達(dá)較低，灌胃后24 h、48 h、72 h三個時相點的CK19陽性染色較對照組明顯增強(qiáng)，主要集中于匯管區(qū)。模型組大鼠灌胃后48 h、72 h的CK19陽性表達(dá)更為明顯。見圖2。

圖 2 兩組大鼠肝組織CK19表達(dá)結(jié)果（免疫組化×50）

2.3 肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝組織PI3K、AKT1、AKT2、AQP8、AQP9各基因mRNA表達(dá)動態(tài)變化 對照組大鼠肝組織PI3K、AKT1、AKT2及下游靶基因AQP8、AQP9的mRNA表達(dá)水平在灌胃后24 h、48 h、72 h基本持平，模型組大鼠肝組織PI3K、AKT1、AKT2及下游靶基因AQP8、AQP9mRNA表達(dá)水平均不同程度低于對照組的同一時相點，除24 h時相點模型組大鼠AKT1、AKT2和AQP8 mRNA表達(dá)水平與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其他均顯著下降（P<0.01）。模型組大鼠在灌服ANIT后PI3K、AKT1、AKT2及其下游靶基因AQP8、AQP9的mRNA表達(dá)水平在48 h達(dá)到最低值，72 h有所恢復(fù)，但明顯低于對照組（P<0.01）。見圖3。

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05圖3 兩組大鼠肝組織PI3K、AKT1、AKT2、AQP8、AQP9各基因mRNA表達(dá)水平比較（±s）

2.4 肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝組織PI3K、AKT1/2、AQP8、AQP9蛋白或磷酸化水平動態(tài)變化 對照組大鼠肝組織PI3K、AKT1/2及下游靶蛋白AQP8、AQP9的蛋白表達(dá)水平和AKT磷酸化水平在灌胃后24 h、48 h、72 h基本持平，模型組大鼠3個時相點的肝組織PI3K、AKT1/2及下游靶蛋白AQP8、AQP9表達(dá)水平和AKT蛋白磷酸化水平均低于對照組，其中AKT磷酸化水平較對照組顯著降低（P<0.01）。模型組大鼠PI3K、AKT及下游靶蛋白AQP8、AQP9的蛋白表達(dá)水平在灌服ANIT后48 h達(dá)到最低值，72 h有所回升，但仍低于對照組。AKT磷酸化水平，在灌服ANIT后24 h、48 h、72 h持續(xù)降低。見圖4和圖5。

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05圖5 兩組大鼠肝組織AQP8、AQP9、AKT蛋白及AKT磷酸化水平比較

圖4 兩組不同時間AQP8、AQP9、PI3K、AKT、P-AKT、β-actin蛋白條帶

3 討論

膽汁淤積的具體機(jī)制尚未完全明確。有研究顯示，膽汁分泌可能與水通道蛋白的調(diào)控有關(guān)［9］。水通道蛋白（AQP）是一系列廣泛分布于哺乳動物、植物和低等生物的跨膜蛋白，充當(dāng)著細(xì)胞水液進(jìn)出的通道［10-11］。在膽汁分泌的過程中，肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞可以介導(dǎo)AQP的表達(dá)，改變水液在細(xì)胞內(nèi)外的流動，建立細(xì)胞膜兩側(cè)濃度差，進(jìn)而調(diào)控膽汁分泌。因此，膽汁淤積可能是AQP表達(dá)減少導(dǎo)致水滲透性降低，無法建立細(xì)胞內(nèi)外濃度差，膽汁無法順利分泌所導(dǎo)致。AQP8、AQP9作為水通道蛋白家族中最重要的蛋白，在膽汁分泌、合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］。研究發(fā)現(xiàn)，靜止?fàn)顟B(tài)下AQP8主要位于細(xì)胞內(nèi)的囊泡中，只有少量AQP8位于細(xì)胞膜、膽管膜［13-14］，AQP9在細(xì)胞膜上的表達(dá)量明顯高于細(xì)胞質(zhì)中［15］。在一定條件下，AQP8、AQP9會向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控水液進(jìn)出［14］，介導(dǎo)膽汁分泌［16］。AQP8、AQP9表達(dá)缺陷會引起膽汁分泌功能障礙，造成膽汁淤積［17-18］，進(jìn)而引起肝損傷。已有實驗證明，肝損傷小鼠肝組織中的AQP9表達(dá)顯著降低［19］。PI3K/AKT作為AQP8、AQP9的上游通路，可以介導(dǎo)調(diào)控囊泡運(yùn)輸和膽汁形成的信號通路［20］，磷酸化的PI3K會促進(jìn)AQP8向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，提高AQP9的表達(dá)［21］。PI3K/AKT通路不僅可以通過調(diào)控下游AQP8、AQP9的轉(zhuǎn)運(yùn)造成肝損傷，也可以直接介導(dǎo)死亡受體，造成肝細(xì)胞凋亡及肝損傷［22］。研究證明，抑制PI3K/AKT的表達(dá)會增加肝臟損傷、炎癥及肝癌的發(fā)生風(fēng)險［23］，成年小鼠肝臟中Akt1和Akt2的缺失會導(dǎo)致慢性肝損傷、炎癥和肝癌。

α-異硫氰酸萘酯（ANIT） 能造成大鼠膽汁淤積性肝損傷，其誘導(dǎo)的大鼠肝損傷病理改變與人類膽汁淤積性肝損傷相似，因此被廣泛用于建立膽汁淤積性肝損傷模型進(jìn)行相關(guān)研究。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠灌服ANTI后出現(xiàn)肝損傷，血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平均顯著高于對照組，提示建模成功。大鼠肝損傷程度在48 h最高，72 h后有所恢復(fù)，提示ANTI的肝毒性隨著作用時間的延長逐漸減弱，說明ANTI誘導(dǎo)的大鼠膽汁淤積性肝損傷模型具有局限性，造模時應(yīng)選擇合適的藥物作用時長。模型組大鼠肝組織CK19染色陽性，提示膽管上皮細(xì)胞增生，出現(xiàn)膽汁淤積。在灌服ANIT后的24 h、48 h、72 h三個時相點，模型組大鼠肝組織PI3K、AKT和靶蛋白AQP8、AQP9的mRNA及蛋白表達(dá)水平、AKT磷酸化水平均低于對照組，提示ANTI誘導(dǎo)大鼠肝損傷會抑制PI3K、AKT、AQP8、AQP9的表達(dá)及AKT的活化。ANIT灌胃48 h后，上述基因表達(dá)抑制最顯著，72 h開始恢復(fù)，與大鼠肝損傷變化趨勢相符，提示PI3K、AKT、AQP8、AQP9的表達(dá)與ANTI誘導(dǎo)大鼠膽汁淤積性肝損傷的機(jī)制密切相關(guān)。但AKT的磷酸化水平在24 h、48 h、72 h三個時相點持續(xù)降低，72 h后未出現(xiàn)明顯回升，提示可能存在新的機(jī)制通過調(diào)控AKT的磷酸化造成大鼠肝損傷，有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，ANTI可以通過抑制PI3K/AKT信號通路的活化來下調(diào)AQP8、AQP9的表達(dá)，且與大鼠的肝損傷變化相一致，但具有時效性，或可能存在未知機(jī)制通過調(diào)控AKT的磷酸化造成大鼠肝損傷。