BIRC3在TNF-α誘導血管平滑肌細胞表型轉化中的作用

郝中偉 劉祖秋 李紅敏 胡巖松 羅學勝

血管平滑肌細胞（VSMC）是動脈血管的主要組成部分，病理條件下VSMC會由“收縮型”向“合成型”轉化，表現為收縮相關蛋白表達下降，細胞外基質成分的分泌活躍，遷移、侵襲能力增強［1］。炎癥因子可誘導VSMC發生表型轉化［2］，進而參與動脈粥樣硬化、血管支架置入術后再狹窄等疾病的發生發展［3-4］。腫瘤壞死因子α（TNF-α）在高血壓、動脈粥樣硬化患者外周血中顯著升高，硬化斑塊組織中也能檢測到TNF-α的高水平富集［5-7］。基礎研究發現，TNF-α可通過誘導VSMC表型轉化參與動脈重塑［8］、泡沫細胞形成［9］、新生內膜增生［10］等病理過程。本研究旨在探索TNF-α誘導VSMC表型轉化的關鍵信號分子，并通過細胞拯救實驗驗證靶向該分子能否阻斷TNF-α對VSMC表型的影響。

1 材料與方法

1.1 轉錄組測序數據下載和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）從基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）下 載GSE115311轉錄組測序表達矩陣，從中提取來自TNF-α處理的VSMC（GSM3175352、GSM3175353）和 正 常VSMC（GSM3175354、GSM3175354）的RNA-seq結果。利用GSEA軟件（4.1.0版），選擇MSigDB庫中c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt基因集進行富集分析。顯著富集標準為校正后的富集分數（normalized enrichment score，NES）絕對值>1.0，錯誤發現率（false discovery rate，FDR）<25%，且P<0.01。

1.2 細胞培養 人主動脈平滑肌細胞購自Gibco公司，于添加平滑肌細胞生長添加劑的231培養基中培養傳代，37 ℃、5% CO2環境條件。取第3～6代細胞進行實驗。

1.3 細胞處理及分組 取對數生長期的VSMC，經2%胎牛血清預處理24 h后進行實驗。在12孔板中加入10 ng/mL 的TNF-α（abcam公司），分別處理0 h、12 h、24 h和48 h，用于檢測桿狀病毒IAP重復序列3（baculoviral IAP repeat-containing 3，BIRC3）的mRNA和蛋白表達。在6孔板中，采用lipofectamine 2000試劑盒，分別將BIRC3特異性干擾RNA（siBIRC3）和陰性對照干擾RNA（siNC）轉入細胞。轉染24 h后，再用TNF-α（10 ng/mL）處理兩組細胞，用于后續實驗。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR） Trizol法提取總RNA。根據逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司）步驟合成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa公司）步驟配制20 μL反應體系進行qRT-PCR反應，每個樣本設3復孔。實驗所用的引物序列：BIRC3上游引物：5'-TTTCCGTGGCTCTTATTCAAACT-3'，下游引物：5'-GCACAGTGGTAGGAACTTCTCAT-3'；α-SMA上游引物：5'-GTGTTGCCCCTGAAGAGCAT-3'，下游引物：5'-GCTGGGACATTGAAAGTCTCA-3'；MYH11上游引物：5'-CGCCAAGAGACTCGTCTGG-3'，下游引物：5'-TCTTTCCCAACCGTGACCTTC-3'；GAPDH上 游 引物：5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，下游引物：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。

1.5 蛋白免疫印跡（western blot，WB）檢測 用SDS裂解液充分裂解細胞，4 ℃、10,000 r/min離心10 min，取上清，獲得總蛋白。BCA法測定上清液濃度，上樣緩沖液配平各個樣品致使每孔上樣30 μg蛋白。經12%SDS-PAGE凝膠電泳后，轉膜至PVDF上。WB封閉液（上海碧云天生物技術有限公司）室溫封閉1 h，4 ℃下孵育一抗過夜。TBST洗滌3次，室溫下孵育二抗1 h。TBST洗滌后，采用增強型化學發光試劑（ECL）進行顯影，成像后使用Image J軟件定量蛋白質條帶。

1.6 平板劃線實驗 使用200μL移液器槍頭在各組細胞的6孔培養板板底中央做出劃痕，無菌PBS緩沖液洗滌去除細胞殘渣。分別在劃痕后0 h和24 h取樣拍照，以0 h的細胞劃痕寬度為基準，計數24 h后遷移至劃痕內的細胞個數，作為遷移能力的定量指標。

1.7 Transwell檢測 采用無血清培養液稀釋的Matrigel包被Transwell上室后，置于室溫下干燥凝固。重懸并調整各組細胞濃度致1×105個/mL。取200μL細胞懸液接種于Transwell上室中，下室中加入500 μL含有10%胎牛血清的培養基，培養24 h后去除小室。吸去培養液后，用棉簽輕輕擦去小室上層細胞，PBS緩沖液洗滌后，采用4%多聚甲醛固定，再用0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡下隨機選取3～5個視野拍照，并進行細胞計數。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism 6統計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉錄組測序的基因集富集分析 GSEA分析發現，NOD-like受體信號通路（P<0.001，NES=1.64，FDR=0.056）相關基因在TNF-α刺激的VSMC中明顯富集，見圖1A。其中，BIRC3基因的表達在TNF-α處理組中顯著上調（logFC=6.3，P<0.01），見圖1B。

2.2 TNF-α上調VSMC中BIRC3的表達 為明確TNF-α對BIRC3表達的影響，分別以10 ng/mL的TNF-α處理VSMC細胞0 h、12 h、24 h和48 h。定量PCR結果提示，TNF-α對BIRC3 mRNA的促表達作用呈時間梯度依賴性。TNF-α處理12 h后，BIRC3的mRNA水平已顯著高于對照組（2.90±0.12，P<0.01），24 h后的表達水平則進一步上調（5.45±0.16，P<0.01），見圖2A。Western Blot結果提示，TNF-α能夠顯著上調BIRC3蛋白在VSMC中的表達，見圖2B。

圖2 TNF-α對VSMC中BIRC3表達的影響

2.3 干擾BIRC3表達逆轉TNF-α對VSMC收縮表型標志物的抑制作用 TNF-α刺激VSMC的同時干擾敲低BIRC3。定量PCR結果提示，siBIRC3組中MYH11（2.43±0.18，P<0.01，見圖3A）和α-SMA（2.57±0.13，P<0.01，見圖3B）的mRNA表達水平均顯著高于對照組。Western Blot結果進一步發現，與對照組比較，siBIRC3組中MYH11和α-SMA蛋白表達明顯升高（見圖3C），提示敲低BIRC3表達能夠阻斷TNF-α對VSMC收縮表型標志物的抑制作用。

圖3 干擾抑制BIRC3對TNF-α處理的VSMC中收縮表型標志物的影響

2.4 干擾敲低BIRC3對TNF-α誘導VSMC遷移的影響 平板劃線實驗結果提示，與對照（siNC）組（68.50±7.53）比較，siBIRC3組細胞的遷移能力（51.0±4.56）顯著減弱，差異有統計學意義（P<0.05），見圖4。

圖4 干擾抑制BIRC3對TNF-α處理的VSMC遷移的影響

2.5 干擾BIRC3表達減弱TNF-α對VSMC的促侵襲作用 Transwell侵襲實驗結果如圖5所示，TNF-α刺激VSMC的同時干擾敲低BIRC3能夠顯著減弱細胞的侵襲能力（25.83±4.27），與對照（siNC）組（44.83±4.15）比較，差異有統計學意義（P<0.01）。

圖5 干擾抑制BIRC3對TNF-α處理的VSMC侵襲能力的影響

3 討論

慢性炎癥反應介導的VSMC表型轉化是許多疾病共同的病理基礎之一［11］，心血管疾病的發病機制錯綜復雜，TNF-α作為引起血管炎癥反應的重要因子，可通過多途徑參與調控VSMC表型轉化［12］。本研究篩選驗證，BIRC3基因的表達在TNF-α處理的VSMC中顯著上調，并通過拯救實驗證明BIRC3是TNF-α誘導VSMC表型轉化的關鍵環節分子。BIRC3，又稱細胞內抑制凋亡蛋白2（cIAP2），是細胞凋亡抑制蛋白家族中的一員，其N末端含有3個相連的桿狀病毒IAP重復結構域（BIR），C末端含有一個指環RING結構域，具有E3泛素連接酶活性。ZHOU等［13］研究表明，TNF-α可促進多種不同類型細胞中BIRC3的表達。本研究也發現，TNF-α能夠顯著上調BIRC3在VSMC中的表達，提示該作用在不同種類細胞間具有一定的保守性。

從蛋白功能角度來看，當TNF-α作用于細胞時，BIRC3的BIR結構域與腫瘤壞死相關因子1、2（TRAF1，TRAF2）形成復合物，并被招募至腫瘤壞死因子受體附近，通過激活NF-κB經典通路影響下游基因的表達，而BIRC3又是受NF-κB正向調控的基因之一［14］。由此可見，TNF-α/BIRC3/NF-κB在胞內可形成正反饋環路，放大TNF-α對細胞的影響［15］。既往研究亦表明，TNF-α/NF-κB是介導VSMC表型轉化的關鍵通路［12］。據此推測，抑制BIRC3的表達或許能夠阻斷TNF-α對VSMC表型的影響。本研究在TNF-α處理VSMC的同時，利用干擾RNA敲低BIRC3的表達，結果顯示BIRC3表達下降能夠顯著阻斷TNF-α對α-SMA和MYH11等收縮表型標志物的抑制作用，并且能夠有效抑制TNF-α對VSMC遷移的促遷移作用。大量研究表明，慢性炎性刺激可促使發生表型轉化的合成型VSMC分泌基質金屬蛋白酶，降解細胞外基質，導致其侵襲性遷移，這也是PCI術后再狹窄等許多心血管疾病發生發展的重要細胞學機制［16］。本研究進一步Transwell實驗發現，抑制VSMC中BIRC3的表達可以有效阻斷TNF-α誘導的細胞侵襲。

綜上，TNF-α可上調VSMC中BIRC3的表達，抑制BIRC3能夠有效阻斷TNF-α誘導的VSMC表型轉化，為治療慢性血管炎癥反應提供新的潛在靶點，但鑒于BIRC3功能的多樣性，其對VSMC表型調控的具體機制有待于進一步研究。