適宜藥渣栽培的靈芝優良菌株篩選與鑒定*

張 鑫，謝 苗，亓小妮，郭雅琳，劉養山，張 景，杜秀菊

（聊城大學生命科學學院，山東 聊城 252000）

靈芝是中藥之寶，素有“仙草”之美譽。最早關于靈芝的記載是《神農本草經》，其中評價靈芝為“上上之藥，方中妙品”[1]，現代藥理學和臨床實踐進一步證實了靈芝的藥理作用，并證實了多糖和三萜是靈芝的主要活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、保肝護肝、降血糖、治療神經衰弱等藥理作用，可以強身健體，延年益壽[2]。目前，靈芝常以生藥材、藥用制劑、保健品飲品等商品面向市場[3]。

我國藥渣年產量每年高達3.4×107t，大多作為廢棄物堆放、填埋或焚燒[4]，造成了嚴重的環境污染和資源浪費。研究表明，藥渣保留了粗纖維和粗脂肪等有效成分，是培養藥用真菌的優良原料[5]。

為找出適合中藥渣培養的靈芝品種，對9種來源不同的靈芝菌株進行了菌種長勢觀察和出芝試驗，基于ITS基因序列同源性關系建立系統發育樹并鑒定其親緣關系[6]。為合理開發中藥渣剩余價值變廢為寶提供理論依據，對靈芝產業的代料栽培拓展空間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株來源

9種靈芝菌株名稱及來源見下表1。

表1 供試菌株編號及其來源Tab.1 Numbers and sources of tested strains

如表1所示，9種靈芝菌株中，7種菌株購于武漢周玉麟食用菌研究所，其他2種靈芝菌株（LD-202023.2和LD-202083.8） 為聊城大學微生物學實驗室從靈芝組織中分離獲得，其子實體來源于山東冠縣靈芝栽培基地，冠縣是全國最大靈芝栽培基地，但冠縣靈芝長期存在量多價低的現象。

1.1.2 培養基

菌種活化培養基CPDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g，補足純水至1 000 mL，pH自然。

菌種擴繁培養基CYPDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、藥渣200 g，純水補足至1 000 mL，pH自然。

菌絲體培養液體培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、藥渣200 g，純水補足至1 000 mL，pH自然。

二級藥渣栽培料配方：中藥渣60%、麥麩38%、石膏1%、葡萄糖1%、磷酸二氫鉀0.4%，料液比約為 1∶1.1～1∶1.3。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及擴繁

在無菌環境下，從9株靈芝菌種的CPDA試管培養基中，挑取菌絲濃、白、健壯的小塊菌絲體接入到CYPDA擴繁平板培養基，27℃培養箱中暗培養5 d～7 d。

1.2.2 靈芝菌株的平板菌絲長勢

用打孔器從每塊擴繁平板中均勻選取相同數量、大小相等的純化菌絲體接入到新的CYPDA平板培養基中，每個平板接種1塊。每日測量菌塊直徑大小，觀察其形態、色澤、密度、邊緣整齊程度[7]，計算菌絲的日生長速率，每個菌株設置3次平行試驗。

1.2.3 液體培養基中菌絲長勢

1.2.1中的CYPDA培養基培養5 d～7 d后，選取2塊直徑1 cm的圓形菌塊，接入到150 mL液體培養基。接種后的液體培養基于搖床25℃、150 r·min-1恒溫避光培養1周，觀察菌絲球形態、顏色、大小、密度、培養基顏色及生物量等指標[8]。

1.2.4 瓶式栽培培養基中菌絲長勢

通過一級培養（1.2.2和1.2.3）觀察菌絲在固體培養基和液體培養基中的長勢，篩選出長勢較好的靈芝菌種進行瓶栽二級培養。觀察菌絲在二級藥渣栽培料中適應程度及生長特征，進一步篩選出藥渣適栽培優良靈芝菌種。

1.2.5 菌絲體DNA提取及凝膠電泳檢測

DNA的提取參照童森淼等[9]和張杰等[10]的方法，并略有改進。選取形態大小適宜的菌絲球，用無菌水清洗后離心去沉淀，-80℃冷凍過夜用于提取DNA[11]。冷凍的菌絲體經高通量組織研磨器研磨，使用CTAB法提取DNA，苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1） 去除蛋白，異丙醇沉淀DNA，酒精洗滌，在TE緩沖液中溶解并保存。1.0%的瓊脂糖凝膠，50×TAE為電泳緩沖液，上樣量為1 μL，121 V電壓電泳35 min，檢測DNA樣品純度[12]。

1.2.6 ITS-PCR擴增及序列測定

采用真菌核糖體基因間隔區通用引物ITS1和ITS4（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC） 進行PCR擴增[13]。引物由金唯智生物科技有限公司合成，擴增在Bio-Rad T100 PCR儀上進行。

采用25 μL反應體系：2×Taq mix（東盛生物科技有限公司） 12.5 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL，下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，總體積25 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。

PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在UVP凝膠成像系統下成像保存。PCR擴增產物由金唯智生物科技有限公司進行單向測序。測得的序列用BioEdit軟件處理后提交至GenBank[14]。

1.2.7 ITS序列分析

測得的序列根據GenBank上已有的靈芝菌株序列運用Blast對獲得的同源序列進行對比分析。通過對9個樣品的ITS序列對比，用BioEdit對構樹進行編輯[15]，再用Muscle進行多次序列排列，最后用MEGA X構建系統發育樹：按照N.J.（Neighbor-joining） 鄰接法，以猴頭菌屬（Hericium） 為外群，經Bootstrap重復構建循環1 000次，來檢驗所構建進化樹的可靠性。

2 結果分析

2.1 試驗靈芝菌株的菌絲長勢

采用Duncan新復極差法[16]，得到9個靈芝菌株在相同CYPDA藥渣培養基中的生長狀況，詳見表2。

表2 9種靈芝菌株的平板菌絲長勢Tab.2 mycelial growth of nine Ganoderma lucidum strains on plate

如表2所示，韓芝1（LD-202023.2） 生長速度最快，可達（2.19±0.35） cm·d-1；其次是大紅芝 （LD-202033.3） 和紫芝 （LD-202083.8） 生長速度較快，分別達到 （1.85±0.23） cm·d-1和（1.81±0.26） cm·d-1；美芝 （LD-202053.5） 和韓芝 （LD-202013.1） 生長速度較慢，分別為（0.71±0.12） cm·d-1和 （0.72±0.20） cm·d-1。

2.2 液體培養基菌種長勢

在25℃、150 r·min-1恒溫避光搖床的相同培養條件下，9種靈芝菌株在液體培養基中的生長狀況見表3。

表3 9種靈芝菌株液體培養長勢Tab.3 Growth of nine Ganoderma lucidum strains with liquid cultivation

如表3所示，韓芝（LD-202013.1）、泰山靈芝（LD-202043.4）、鹿角靈芝 （LD-202063.6） 和 G10（LD-202093.9） 的菌絲球為刺狀；大紅芝（LD-202033.3） 和紫芝 （LD-202083.8） 的菌絲球為梭狀；美芝 （LD-202053.5） 和黑芝 （LD-202073.7）的菌絲球為圓球狀；韓芝1（LD-202023.2） 的菌絲球為顆粒狀。韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3） 和紫芝（LD-202083.8） 的菌絲球數量較多且生長較快，且除韓芝 （202013.1） 和美芝（202053.5）以外，其他菌株的菌絲球大小都均勻。

2.3 瓶式栽培培養基中菌絲長勢

結合平板培養和液體培養菌絲生長情況，挑選了韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3）、泰山（LD-202043.4）、黑芝（LD-202073.7）、紫芝（LD-202083.8） 5個菌種進行瓶式栽培，培養菌絲生長狀況見表4。

表4 瓶式栽培培養基中5種靈芝菌種的菌絲長勢Tab.4 Mycelial growth of five Ganoderma lucidum strains in bottle culture medium

如表4所示，在藥渣培養基中，大紅芝、韓芝、紫芝3個菌株的菌絲生長速度較快且菌絲最為粗壯、濃密、純白。黑芝和泰山靈芝，生長速度較慢，菌絲長勢一般。菌株的菌絲長勢強弱可以作為評價靈芝菌株優劣的重要指標[17]，綜合各項指標，大紅芝、韓芝、紫芝3個菌株更適合于藥渣培養基進行栽培。

2.4 子實體形態及生物學效率比較

一級、二級培養優良菌株中，選擇韓芝1（LD-202023.2）、紫芝（LD-202083.8） 2種長勢較好的靈芝菌株進行三級栽培管理，采用直徑10 cm、長30 cm的高密度聚乙烯菌袋。其菌蓋生長情況和生物學效率見表5。

表5 子實體形態及生物學效率Tab.5 Fruit body morphology and biological efficiency

如表5所示，紫芝（LD-202083.8） 和韓芝1（LD-202023.2）的生物學效率均達到30%以上。

2.5 DNA電泳圖分析

9個靈芝ITS-PCR電泳圖見圖1。

圖1 供試靈芝菌種ITS-PCR電泳圖Fig.1 ITS-PCR electrophoresis of tested Ganoderma lucidum strains

如圖1所示，9個靈芝菌株樣品均有較為清晰的擴增條帶，菌株的ITS-PCR序列的片段在750 bp左右，在長度上具有比較好的保守性，表明此特異引物具有較強的特異性，適用于靈芝菌種的分子鑒定[18]。

2.6 系統發育樹分析

測序結果登錄NCBI經Blast比對。韓芝1（LD-202023.2） 與 NR 164049.1（G.sandunense） 的期待值（E值）為0，有效序列長度高達97%，相似度為95.95%；大紅芝 （LD-202033.3） 與 NR 132919.1（G.desttructans） 的期待值為0，有效序列長度高達100%，相似度為94.77%；紫芝（LD-202083.8） 與NR 132919.1（G.desttructans） 的期待值為0，有效序列長度高達100%，相似度為94.86%，確定這三個菌株均為Ganoderma的不同株系。選取相似度高的前7個序列，基于ITS基因使用鄰近法所構建的系統發育樹見圖2。

由圖2可以看出，菌株韓芝（LD-202013） 與NR 152892.1（G.sichuanense）、泰山靈芝 （LD-202043.4）、美芝（LD-202053.5）、鹿角靈芝（LD-202063.6）、G10（LD-202093.9） 等菌株的 ITS序列同源性較高，序列一致為99.26%；黑芝（LD-2020273.7） 與 NR 164048.1 （G.nasalanense） 菌株的同源性較高，序列一致性為94.21%；紫芝（LD-202083.8） 與韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3）的菌株的同源性較高。

圖2 基于ITS的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS

系統發育樹結果顯示，韓芝（LD-202013.1）、泰山靈芝 （LD-202043.4）、美芝 （LD-202053.5）、鹿角靈芝 （LD-202063.6）、G10（LD-202093.9） 與NR 164435.1（G.meredithae） 聚為一支，與 NR 152892.1（G.sichuanense）的遺傳距離最小，親緣關系最近；黑芝（LD-2020273.7） 與NR 158431.1（G.angustisporum） 聚為一支，與NR 164048.1（G.nasalanense）的遺傳距離最小，親緣關系最近[19]；菌株紫芝（LD-202083.8）與韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3）聚為一支且遺傳距離最小，親緣關系最近。

3 結論與討論

經過一級、二級、三級菌種的藥渣栽培試驗，以9個菌株的菌絲長勢和靈芝子實體性狀為主要依據進行篩選。結果表明，韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3） 和紫芝（LD-202083.8） 更適合藥渣栽培。

已有的研究表明，靈芝屬ITS序列的種間序列相似性低于94%，種內相似性高于98%[20]。通過對9種靈芝菌株的ITS序列與NCBI中檢索的7種相似序列進行系統發育樹分析，表明韓芝（LD-202013.1）、黑芝 （LD-2020273.7） 分別與 NR 164435.1（G.meredithae）、NR 132919.1 （G.destructans） 相似度高達100%，應屬于同一種；紫芝（LD-202083.8） 與韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝（LD-202033.3） 相似度高達99%，應屬于同一種[21]。

適合藥渣栽培的3個菌株：韓芝1（LD-202023.2）、大紅芝 （LD-202033.3） 和紫芝 （LD-202083.8），韓芝1菌絲長勢最強，為藥渣栽培的最佳菌株。得到最佳菌株，即可充分利用藥渣的剩余價值，變廢為寶，有望能夠完全或部分替代木糖醇渣或棉籽殼等傳統主料，節約成本、提高投入產出比，有助于鄉村振興，促進生態文明建設。