1BL/1RS 易位小麥面筋蛋白的分離重組及其面條品質(zhì)研究

李 婷，李 雙，周小玲，王發(fā)祥，俞 健，劉永樂，李向紅?

（1. 長沙理工大學(xué) 化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2. 克明面業(yè)股份有限公司，湖南 長沙 410116）

小麥?zhǔn)俏覈娜笾骷Z之一，也是全球重要的谷物品種，年產(chǎn)量已超1 億t[1]。小麥經(jīng)磨制加工后即為面粉，小麥的營養(yǎng)成分包括淀粉、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，主要營養(yǎng)在小麥胚中，是小麥蛋白質(zhì)的主要來源[2]。小麥蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中，清蛋白和球蛋白為小麥提供營養(yǎng)成分，醇溶蛋白和谷蛋白兩者構(gòu)成面筋蛋白，為面條提供網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。小麥面筋蛋白的質(zhì)量和含量對(duì)面條的品質(zhì)具有很大的影響，當(dāng)小麥中含有較高含量的面筋蛋白時(shí)，面條的硬度會(huì)顯著增加，韌性也會(huì)顯著增大，并且當(dāng)面筋蛋白含量一定時(shí)，谷蛋白與醇溶蛋白的比值不同，面團(tuán)的品質(zhì)也會(huì)有所不同[3]。

面粉制品種類豐富，廣受人民的喜愛，掛面就是典型的面制品之一，掛面在我國的市場廣闊，與此同時(shí)，其可提升空間也十分巨大。小麥的質(zhì)量品質(zhì)、磨粉設(shè)備和制作工藝的限制都使得直接生產(chǎn)出來的小麥粉成品通常難以滿足某些食品生產(chǎn)的具體要求，食品工業(yè)中通常使用物理的、化學(xué)的或生物的方法來有目的地改善小麥粉的品質(zhì)[4]。近年來，國內(nèi)對(duì)面條品質(zhì)的影響的研究主要是從面粉的組成成分如淀粉、蛋白質(zhì)等開展[5]，也有研究集中在醇溶蛋白易位和不同分子量谷蛋白對(duì)面條品質(zhì)的影響，基因和蛋白質(zhì)組學(xué)有助于揭示食品或加工產(chǎn)品的深層質(zhì)量變化機(jī)制[6-7]。分離重組法常用于研究面粉的各項(xiàng)成分對(duì)面條品質(zhì)的影響，是在盡可能保證面條中原成分的性質(zhì)不變的條件下，用合適的方法將面粉中的組分分離出來，然后再通過改變其中成分的比例或者對(duì)其中的成分進(jìn)行修飾，重新組合，以確定這些成分對(duì)面條質(zhì)量的影響，能夠避開統(tǒng)計(jì)分析法和掃描電鏡（SEM）觀察法的弊端，盡可能準(zhǔn)確的反應(yīng)真實(shí)的情況[8]。

因此，本研究將以克明面業(yè)提供的兩種優(yōu)質(zhì)面條小麥粉（SJ 和HMT）為研究對(duì)象，利用分離重組技術(shù)制備面條，通過對(duì)面條的蒸煮特性及質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行測定，明晰小麥面粉中醇溶蛋白與谷蛋白的比例及不同分子量的麥谷蛋白對(duì)面條品質(zhì)的影響，為小麥種植、面條專用粉生產(chǎn)和面條的品質(zhì)提高提供堅(jiān)實(shí)的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

淀粉、小麥粉（SJ、HMT）、標(biāo)樣小麥：湖南省長沙市克明面業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LYZY-2 沉降值測定儀：廣州滬瑞明儀器有限公司；LGJ-10 真空冷凍干燥機(jī)：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；DYCZ-25D 電泳儀：北京六一生物科技有限公司；T10 basic 手持式均質(zhì)機(jī)：德國IKA公司；等電聚焦儀：美國GE 公司；ScanMaker i800掃描儀：上海中晶科技有限公司；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：天津予華儀器科技有限公司；TA.XT.Plus食品物性測定儀：英國Stable Micro System 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小麥粉基本成分測定

分別參照 GB 5009.4—2016、GB 5009.5—2016、GB 5009.3—2010、GB/T 14685—1995 測定小麥粉灰分含量、蛋白質(zhì)含量、水分含量及沉降值。

濕面筋含量與面筋指數(shù)測定：將洗凈的面筋放入面筋指數(shù)測定儀小篩板中，將篩板裝至儀器中，進(jìn)行離心，離心完畢，取出篩板，稱量篩上物與篩下物質(zhì)量。濕面筋含量即為篩上物與篩下物的總重。面筋指數(shù)計(jì)算方法見公式：

1.3.2 小麥粉高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

麥谷蛋白提取及樣品制備：稱取小麥粉約2 g，使用NaCl 溶液去除球蛋白并重復(fù)兩次，再使用醇溶液除去醇溶蛋白，重復(fù)兩次。將醇提所得沉淀用20 mL 2%十二烷基硫酸鈉提取液在室溫下提取2 h。經(jīng)過離心（4 000 r/min，20 min），得到上清液保留準(zhǔn)備進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

SDS-PAGE 方法如下：將上述20 μL 上清液蛋白樣品與等體積的樣品緩沖液混合，水浴后離心備用。先恒流（20 mA）條件下電泳1 h 左右，待樣品進(jìn)入分離膠換成恒壓（50 mA）條件電泳3 h 左右。電泳完畢后，置于染色盤中，加入50 mL固定液固定1 h，倒掉固定液，再染色2 h，染色結(jié)束加入脫色液脫色，并不斷更換脫色液直至脫色完全，使用凝膠成像掃描儀掃描凝膠。

1.3.3 醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）分析

醇溶蛋白提取及樣品制備：稱取小麥粉約0.03 g，加入0.4 mL 提取液（0.05 g 甲基綠，25 mL 2-氯乙醇，1 mL β-巰基乙醇定容至100 mL），在4 ℃下靜止24 h 后，8 000 r/min 離心10 min 后，取上清液進(jìn)行A-PAGE 分析。

A-PAGE 方法如下：用20 mL 凝膠溶液（25 g丙烯酰胺，1 g N-N-亞甲基雙丙烯酰胺，15 g 尿素，0.25 g 抗壞血酸，0.006 5 g 硫酸亞鐵，5 mL冰醋酸，0.25 g 甘氨酸定容至250 mL）對(duì)樣品進(jìn)行電泳。加入70 μL 0.6%過氧化氫后，迅速加入電極緩沖液（40 mL 冰醋酸和0.4 g 甘氨酸定容至1 000 mL），電泳時(shí)恒定電壓為500 V，電泳時(shí)間為甲基綠指示劑移動(dòng)至凝膠底部所需時(shí)間的三倍。電泳結(jié)束后，用10%三氯乙酸固定凝膠，染色結(jié)束加入脫色液脫色，使用7%醋酸對(duì)凝膠進(jìn)行保存，使用凝膠成像掃描儀掃描凝膠。

1.3.4 原小麥面條質(zhì)構(gòu)特性測定

將原小麥粉于面粉攪拌器中，攪拌完畢，將面團(tuán)用壓延輥進(jìn)行多次壓延，壓延完成后將面皮卷在木軸上繼續(xù)醒發(fā)20 min 后用面條切割輪制作面條；制得的面條放入烤箱烘烤，烘干后取出置于密封袋內(nèi)保存。取適量原小麥面條按照其最佳蒸煮時(shí)間煮制后在冷水中靜置2 min 后撈出，用濾紙吸干其表面大部分水分，使用TA-XT Plus 物性分析儀測定其質(zhì)構(gòu)特性。

1.3.5 醇溶蛋白和谷蛋白的分離提取

取適量面粉按照料液比2∶1 加入水，充分揉混成表面光滑的面團(tuán)。揉混完成后向容器中加入適量水，靜置20 min。再將面團(tuán)反復(fù)在水下搓洗，直至溶液澄清時(shí)，得到面筋。將洗得的面筋按照料液比1∶10 加入70%的乙醇，先用均質(zhì)機(jī)將樣品處理為均勻的漿狀，再在35 ℃下攪拌3 h，攪拌完成后，3 500 r/min 下離心30 min，得到上清液和沉淀部分。沉淀即為谷蛋白；上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，沉淀即為麥醇溶蛋白。兩次沉淀均經(jīng)真空冷凍干燥后即得所需蛋白成品。

1.3.6 重組面條的制作

按照原面粉∶混合粉（淀粉、麥醇溶蛋白和麥谷蛋白）=1∶1 進(jìn)行重組粉的配制，其中保持重組粉內(nèi)的蛋白質(zhì)總含量不變，改變蛋白質(zhì)含量中谷蛋白與醇溶蛋白的比值，同時(shí)所有的成分都按照14%的濕基進(jìn)行校正。取1 kg 重組粉于面粉攪拌器中，攪拌完畢，將面團(tuán)用壓延輥進(jìn)行多次壓延，壓延完成后將面皮卷在木軸上繼續(xù)醒發(fā)20 min 后用面條切割輪制作面條；制得的面條放入烤箱烘烤，烘干后取出置于密封袋內(nèi)保存。

1.3.7 重組面條蒸煮特性測定

干物質(zhì)吸水率的測定：取20 根重組面條，稱重，燒杯需烘干至恒重。將稱重后的面條放入裝有500 mL 沸水的燒杯中煮至最佳蒸煮時(shí)間撈出，置于100 mL 冷水中冷卻2 min，冷卻后撈出在濾紙上瀝水5 min 之后再次稱重，面條增加的質(zhì)量與干面條的質(zhì)量的比值即為面條的干物質(zhì)吸水率。

干物質(zhì)損失率的測定：將上述步驟中煮制及浸泡面條的水混合后繼續(xù)在電爐上加熱煮沸，將大部分水分蒸發(fā)掉后把燒杯放入烘箱（105 ℃）內(nèi)烘干至恒重，燒杯增加的質(zhì)量與干面條質(zhì)量的比值即為面條的干物質(zhì)損失率。

1.3.8 重組面條質(zhì)構(gòu)特性測定同1.3.4 對(duì)重組面條質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行測定。

1.3.9 重組面條感官評(píng)定

取60 根長度為22 cm 的面條，煮至最佳蒸煮時(shí)間后撈出，置于冷水中浸泡2 min，分放至事先準(zhǔn)備好的小碗中待品嘗。參照SB/T 10137-93 對(duì)面條進(jìn)行評(píng)定。

表1 面條品嘗項(xiàng)目和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Noodle tasting items and scoring criteria

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用軟件Excel 2010 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類整理及繪圖，采用SPSS 軟件進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種小麥粉基本性質(zhì)比較

兩種小麥粉的基本成分含量如表2 所示，蛋白質(zhì)含量和面筋指數(shù)大致相同，但沉淀值含量有顯著性差異。麥谷蛋白主要以聚合體的形式存在，通過分子間二硫鍵作用形成線狀結(jié)構(gòu)[9]，賦予面團(tuán)彈性。根據(jù)SDS-PAGE 圖譜上遷移速率，可將麥谷蛋白進(jìn)一步分為分子量介于10～70 kD 之間的低分子量麥谷蛋白亞基（LMW-GS）和分子量介于80～140 kD 之間的HMW-GS[10-11]。HMW-GS 僅占成熟種子蛋白質(zhì)總量的10%左右，但它決定了小麥加工品質(zhì)的35%～40%[12]。從兩種小麥品種中提取的谷蛋白SDS-PAGE圖譜如圖1 所示，兩種小麥粉的高分子量麥谷蛋白亞基分別為SJ（1, 7+8, 5+10），HMT (1, 7+8, 5+10)，兩者無顯著差異，只有低分子量麥谷蛋白組成有較明顯的差異。HMW-GSs（1, 13+16, 14+15, 5+10）對(duì)面團(tuán)加工質(zhì)量有積極的影響，亞基（1, 5+10）對(duì)提高面條品質(zhì)具有重要作用[13-14]。如圖2 所示，根據(jù)A-PAGE圖譜的相對(duì)遷移率，小麥醇溶蛋白被分為α、β、γ和ω 四個(gè)部分，兩種小麥品種均出現(xiàn)1BL/1RS 易位特征性條帶。1BL/1RS 易位系1RS 上引入黑麥堿基因，在1BL 上缺少低分子量谷蛋白和部分醇溶蛋白，從而影響面條品質(zhì)。He 等研究發(fā)現(xiàn)小麥品種1BL/1RS 易位會(huì)導(dǎo)致面條的彈性及粘性下降，對(duì)面條的彈性、粘性等有顯著的負(fù)面影響[15]，原小麥面條的質(zhì)構(gòu)評(píng)價(jià)見表3。

表2 原小麥粉基本成分指標(biāo)Table 2 Basic composition indicators of different varieties of wheat flour

表3 原小麥面條的質(zhì)構(gòu)評(píng)價(jià)Table 3 Textural evaluation of high-quality wheat noodles

圖1 SDS-PAGE 圖譜Fig. 1 SDS-PAGE patterns

圖2 A-PAGE 圖譜Fig.2 A-PAGE patterns

2.2 重組面條的蒸煮特性

面條的蒸煮特性常被作為面條品質(zhì)判定的項(xiàng)目之一，淀粉顆粒和面筋蛋白結(jié)構(gòu)之間的相互作用規(guī)律也能夠間接地被反映出來[16]。當(dāng)重組面條內(nèi)的蛋白質(zhì)含量不變時(shí)，醇溶蛋白的含量增加能夠使得重組面條的吸水率顯著增大，見圖3；而兩種重組面條的干物質(zhì)損失率都沒有太大變化，見圖4。根據(jù)相關(guān)性結(jié)果顯示，重組面條重組面條的吸水率與谷蛋白和醇溶蛋白的比值呈顯著負(fù)相關(guān)，而與干物質(zhì)損失率無顯著相關(guān)性，見表4。干物質(zhì)的損失率是由淀粉從蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中脫離出來而流失造成的，因此，蛋白質(zhì)含量高的面粉中的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，能夠減少淀粉分子的流失，從而減少面條的干物質(zhì)損失率[17]，本次實(shí)驗(yàn)中重組面條中的淀粉和蛋白質(zhì)含量都是一定的，只對(duì)谷蛋白和醇溶蛋白的比值進(jìn)行了調(diào)整，故重組面條的干物質(zhì)損失率沒有明顯變化。

表4 相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis

圖3 重組面條吸水率Fig.3 Reconstituted noodles water absorption

2.3 重組面條的質(zhì)構(gòu)特性

當(dāng)醇溶蛋白的含量增加時(shí)，重組面條的硬度顯著減小，粘度顯著增大；當(dāng)谷蛋白的含量增加時(shí)，重組面條的堅(jiān)實(shí)度和剪切做功都顯著增大，且拉伸力和拉伸距離也顯著增大，見表5、表6。當(dāng)重組面條中的蛋白質(zhì)含量一定時(shí)，重組面條的粘度和麥谷蛋白與麥醇溶蛋白的比值呈顯著線性負(fù)相關(guān)；而重組面條的拉伸力、拉伸距離、硬度、堅(jiān)實(shí)度和剪切做功和麥谷蛋白與麥醇溶蛋白的比值呈顯著正線性相關(guān)，見表7。面條的堅(jiān)實(shí)度和剪切做功都能反映出面條的硬度和彈性，谷蛋白賦予面條硬度和彈性，這是由于麥谷蛋白的亞基之間能夠形成疏水作用、氫鍵和分子間二硫鍵，這能夠使麥谷蛋白聚合形成大分子聚合物，這種大分子聚合物形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的硬度和彈性，也是賦予面條硬度和彈性的主要原因[18]。面條硬度和面條抗拉伸強(qiáng)度由谷蛋白決定，醇溶蛋白賦予面條粘度，因?yàn)辂湸既艿鞍變?nèi)含有較高的非極性氨基酸含量，所以其水合時(shí)具有極高的粘度，較小的抗伸長性，面條的延展性和粘性與麥醇溶蛋白密切相關(guān)[19]。但是在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，較高的谷蛋白含量也能夠使面條的延展性顯著增強(qiáng)，當(dāng)面條中含有較高的麥谷蛋白含量時(shí)，能夠形成大量的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種具有彈性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)同樣能賦予面條良好的延展性，故重組面條的拉伸力和拉伸距離都隨谷蛋白含量的相對(duì)含量增加而增大。

表5 重組面條的質(zhì)構(gòu)評(píng)價(jià)（SJ）Table 5 Textural evaluation of reconstituted noodles (SJ)

表6 重組面條的質(zhì)構(gòu)評(píng)價(jià)（HMT）Table 6 Textural evaluation of reconstituted noodles (HMT)

表7 相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis

2.4 重組面條的感官評(píng)定

根據(jù)感官評(píng)定結(jié)果可以看出，十個(gè)樣品的評(píng)分都相對(duì)較低，都在70 分左右，表示重組面條的品質(zhì)還有待進(jìn)一步提升，見表8、表9。其原因可能是混合粉中只有淀粉、麥醇溶蛋白和麥谷蛋白三種成分，即使再與原面粉1∶1 混合，仍缺少了原面粉中的脂質(zhì)等成分，并且制得的蛋白的活性也可能受到了一定的影響，達(dá)不到原面粉的效果。

表8 重組面條感官評(píng)定結(jié)果（SJ）Table 8 Sensory evaluation results of reconstituted noodles (SJ)

表9 重組面條感官評(píng)定結(jié)果（HMT）Table 9 Sensory evaluation results of reconstituted noodles (HMT)

3 結(jié)論

本研究明確了兩種優(yōu)質(zhì)小麥粉的基本成分、高分子量谷蛋白亞基及醇溶蛋白1BL/1RS 易位情況，通過分離重組方法制作了不同麥谷蛋白和麥醇溶蛋白比例的重組面條，對(duì)重組面條的蒸煮特性和質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn)：當(dāng)重組面條中的蛋白質(zhì)含量一定時(shí)，重組面條的吸水率、粘度與麥谷蛋白與麥醇溶蛋白的比值呈顯著線性負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；而重組面條的拉伸力、拉伸距離、硬度、堅(jiān)實(shí)度和剪切做功和麥谷蛋白與麥醇溶蛋白的比值呈顯著正線性相關(guān)（P＜0.05）。本文能夠?yàn)樾←湻N植、面條專用粉生產(chǎn)和面條品質(zhì)提高提供理論依據(jù)，但小麥粉品種產(chǎn)地較為單一，關(guān)于基因和蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)面條品質(zhì)的研究亦有待更為深入的研究。